研究背景:白血病细胞逃逸机体的免疫杀伤在白血病发生发展中具有重要作用。越来越多的研究已经证实融合基因或基因突变除了导致白血病细胞的生长、增殖、分化异常以外,同时还赋予白血病细胞免疫逃逸特性。此外,尽管随着越来越多新药和靶向药物的问世,现代化疗可以使大部分AML患者获得完全缓解,但复发率高仍是急需解决的难题。同时白血病复发也是AML患者接受异基因造血干细胞移植后死亡的首要原因。白血病复发涉及多个环节,其中白血病细胞逃逸免疫监视是复发的重要环节。NK细胞介导的非特异性免疫杀伤作用在抗白血病免疫监视中占有重要地位,NK细胞的活性由表面活化性受体和抑制性受体的平衡来调控。NKG2D为NK细胞表面最重要的活化性受体之一,通过识别肿瘤细胞表面的NKG2D配体,从而激活NK细胞,杀伤肿瘤细胞。AML细胞可通过多种途径使细胞表面的NKG2D的配体表达降低或缺失,从而逃逸NK细胞的杀伤,但具体的调控机制尚不明确。转录因子C/EBPα是重要的髓系分化转录因子,在正常核型的AML患者中,有约10%-15%患者存在C/EBPα的编码基因CEBPA基因突变。本课题组在前期研究中通过对AML细胞过表达C/EBPα-P42蛋白后,进行NK细胞体外杀伤实验,证实C/EBPα-P42蛋白过表达可提高AML细胞对NK细胞杀伤的敏感性,提示C/EBPα蛋白参与调节AML细胞对NK细胞的杀伤敏感性。本研究进一步揭示CEBPA基因野生型及其临床常见突变体调控AML细胞对NK细胞杀伤敏感性的分子机制。第一章 C/EBPα蛋白通过调控AML细胞NKG2D配体的表达影响AML细胞对NK细胞杀伤的敏感性目的:研究转录因子C/EBPα蛋白的表达对AML细胞对NK细胞杀伤作用的敏感性的影响及其对AML细胞表面NKG2D的配体的表达是否具有调节作用。方法:选取5种不同的AML细胞株,通过免疫印迹法（Western blotting）及RT-qPCR分别在蛋白水平及转录水平检测细胞株内源性C/EBPα蛋白表达,通过流式细胞术（Flow cytometry,FCM）检测细胞株表面NKG2D配体ULBPs及MICA/B表达水平。收集初次诊断的临床AML患者的骨髓标本及健康对照者的骨髓标本,分离骨髓单个核细胞,RT-qPCR检测其内源性C/EBPα表达水平与ULBPs表达水平。将5种AML细胞株分别与人原代NK细胞共培养行NK细胞杀伤试验,PI/CFSE双染法检测不同AML细胞株对NK细胞杀伤作用的敏感性。CD107a及CD56标记与AML细胞共培养的NK细胞,检测NK细胞的脱颗粒水平。利用LV3（H1/GFP＆Puro）-shCEBPA（human）-1 和 LV3（H1/GFP＆Puro）-shCEBPA（human）-2质粒包装慢病毒,感染U-937细胞株,建立稳定敲降C/EBPα蛋白表达的细胞亚株:U-937-shCEBPA-1 和 U-937-shCEBPA-2,以及感染对照质粒的 U-937-shNC的细胞亚株。通过Western blotting和RT-qPCR检测敲降后及对照组细胞表达C/EBPα蛋白的变化,流式细胞检测其表面ULBPs表达的变化,PI/CFSE双染法检测其对NK细胞杀伤作用的敏感性的变化。结果:不同的AML细胞株中,HL-60、U-937、THP-1细胞内源性C/EBPα蛋白表达水平高,同时细胞表面表达NKG2D配体ULBPs的水平也高。相反,NB-4和KG-1细胞内源性C/EBPα蛋白表达水平低,细胞表面ULBPs表达水平也低。这5株AML细胞表面MICA/B表达均低,细胞株彼此之间无明显差异。在临床样本中,AML患者的骨髓单个核细胞CEBPA基因表达较健康对照者明显下降,相应地,ULBP2/6水平也低下。杀伤实验中,内源性C/EBPα蛋白表达高的HL-60、U-937、THP-1细胞对NK杀伤敏感性高,NK细胞的脱颗粒水平高。相反,内源性C/EBPα蛋白低表达的NB-4和KG-1细胞对NK杀伤敏感性低,共培养后NK细胞的脱颗粒水平也相对低下。敲降对NK细胞杀伤敏感的U-937细胞的内源性C/EBPα蛋白表达后,其表面ULBPs表达下降,对NK细胞杀伤的敏感性也下降。结论:C/EBPα蛋白促进AML细胞表面ULBPs的表达,促进NK细胞对AML细胞的识别和杀伤。第二章 CEBPA基因野生型及不同类型的突变体影响AML细胞NKG2D配体ULBPs表达的分子机制目的:本部分旨在揭示C/EBPα蛋白作为转录因子调控对NKG2D配体ULBPs表达的分子机制。进一步探讨临床AML患者中常见的CEBPA基因的3种类型突变体,对AML细胞的ULBPs表达的不同作用和分子机制。为C/EBPα蛋白及其突变体参与AML细胞逃逸NK细胞识别和杀伤作用提供理论基础,为白血病免疫治疗提供新思路。方法:通过带FLAG标签的质粒转染,在HEK293T细胞中过表达C/EBPα-P42蛋白,并过表达vector质粒作为对照。收集293 T-CEBPA-P42细胞和293 T-vector细胞,甲醛交联固定细胞,制备细胞核,得到交联染色质制剂,消化染色质并行浓度分析,加入抗FLAG标签的抗体行染色质免疫沉淀,从抗体/蛋白质G磁珠复合物中洗脱染色质,并进行反向交联,DNA纯化。将纯化后的DNA行高通量测序—染色质免疫共沉淀测序（Chromatin immunoprecipitation-sequencing,ChIP-seq）。测序结果提示C/EBPα蛋白在ULBPs基因附近可能的7个结合位点。根据结合位点序列制作双荧光素酶报告基因质粒,筛选和验证C/EBPα蛋白能结合并促进下游基因转录的位点。并进一步根据ChIP-seq实验推测的C/EBPα蛋白可能结合的模体（motif）序列,构建将候选motif序列缺失的双荧光素酶报告基因质粒,再次验证C/EBPα蛋白结合的ULBPs基因的motif序列。通过质粒转染在HEK293 T细胞中过表达C/EBPα-P42蛋白（293T-CEBPA-P42细胞）,过表达C’端bZIP区域重复突变（914-916dup）导致氨基酸序列重复（Gln305dup）的突变体 CM（293T-CEBPA-CM细胞）,N’端TAD1重复突变（247dupC）产生的截短的30KDa蛋白（P30）（293T-CEBPA-P30细胞）,以及过表达N’端TAD2重复突变（584-589dup）导致氨基酸序列重复（His195-pro196dup）的胚系突变 C/EBPα-GM突变体（293T-CEBPA-GM细胞）。根据C/EBPα蛋白可结合的靶基因ULBPs位点序列设计 qPCR 引物,收集 293T-CEBPA-P42 细胞、293T-CEBPA-CM 细胞、293T-CEBPA-P30 以及 293T-CEBPA-GM 细胞行 ChIP-qPCR 实验,另根据 C/EBPα蛋白可结合的靶基因ULBPs位点序列构建双荧光素酶报告基因质粒,在293T-CEBPA-P42 细胞、293T-CEBPA-P30 细胞以及 293T-vector 细胞中行双荧光素酶报告基因实验,检测不同突变体对ULBPs基因的motif序列位点的结合能力的改变,以及调节ULBPs基因表达能力的变化情况。结果:在6号染色体上ULBPs基因附近找到7个C/EBPα蛋白可能的结合位点,ChIP-qPCR实验及双荧光素酶报告基因实验确定C/EBPα蛋白可结合位点为chr6:150010787-150011203,并促进下游UL8P2/5/6基因的转录。该结合位点在ULBP1的转录起始位点上游4.7kb,ULBP2的转录起始位点上游6.9kb,在ULBP5的转录起始位点上游8.4kb,在ULBP6的转录起始位点下游1.4kb的位置。当将chr6:150010787-150011203位点序列中2个C/EBPα蛋白可能结合的motif序列进行突变缺失后,C/EBPα蛋白与该位点的结合能力明显下降。胚系突变GM突变体保留与chr6:150010787-150011203结合,并促进下游ULBP2/5/6基因转录的能力。缺失bZIP结构域的CM突变体失去与该位点结合的能力,而截短的C/EBPα-P30突变蛋白与该位点的结合能力下降。同时双荧光素酶报告基因实验进一步证实,即使截短的P30蛋白可与该位点结合,却失去促进下游ULBP2/5/6基因表达的能力。结论:C/EBPα蛋白作为转录因子,其C’端bZIP结构域与6号染色体上ULBPs基因附近的位点“chr6:150010787-150011203”相结合,并促进下游ULBP2/5/6基因的表达,促进AML细胞表面NKG2D受体ULBPs表达,促进NK细胞对AML细胞表面ULBPs的识别,促进NK细胞行使免疫监视和细胞杀伤作用。胚系突变GM突变体保留与ULBPs基因附近位点结合并促进下游ULBP2/5/6基因表达的能力,缺失bZIP结构域的CM突变体失去与该位点结合的能力,截短的P30蛋白虽保留有结合能力,但失去促进下游ULBPs基因表达的能力,有利于AML细胞逃逸NK细胞的识别和杀伤。第三章 表观遗传药物恢复C/EBPα蛋白低表达的AML细胞对NK细胞杀伤敏感性的研究目的:内源性C/EBPα蛋白低表达可导致AML细胞表面ULBPs表达降低,本部分旨在寻找可以升高ULBPs表达,提高AML细胞对NK细胞杀伤敏感性的药物,为AML治疗提供新的选择。方法:从包含932种表观遗传相关的活性小分子的生化表观遗传药物库中挑选出71种小分子化合物,分别与NB-4细胞（内源性C/EBPα蛋白低表达）进行共培养,48H后流式检测NB-4细胞表面ULBPs表达变化情况,筛选出3种可以显著升高ULBPs表达的小分子化合物。将3种化合物按不同的浓度梯度再次与NB-4细胞共培养,进一步确定其升高ULBPs的作用,并验证作用强弱与药物浓度的关系。重度免疫缺陷小鼠 NOD/ShiLtJGpt-Prkdcem26Il2Tgem26Cd22/Gpt（NCG）尾静脉注射pHIV-luciferase-zsgreen质粒包装的慢病毒感染的NB-4细胞,成功建立可活体成像的人源化白血病小鼠模型,后给予腹腔注射前期筛选有效的表观遗传学药物,尾静脉注射人NK细胞,体内验证前期筛选有效的表观遗传学药物是否可通过升高NB-4细胞表面ULBPs的表达,提高NK细胞对NB-4细胞的杀伤效率。最后,进一步检测了目前临床常用的去甲基化药物地西他滨对NB-4细胞表面的ULBPs表达的影响。结果:从生化表观遗传小分子药物库中,筛选出3种可以不同程度升高AML细胞表面ULBPs表达的药物,分别为 LSD1 抑制剂—反苯环丙胺盐酸盐（Tranylcypromine（2-PCPA）hydrochloride）、DNA/RNA 合成抑制剂—克拉夫定以及酪氨酸酶抑制剂—肉桂酸甲酯,且升高ULBPs的作用随着药物浓度的升高而升高。其中2-PCPA升高ULBPs的作用最强,故选取该药物进一步行人源化白血病小鼠体内杀伤实验,结果提示相比较空白对照组,单纯注射NK细胞组的小鼠肿瘤负荷降低,而同时注射NK细胞和2-PCPA组的小鼠与单纯注射NK细胞组相比,肿瘤负荷进一步明显下降。此外,目前常用的去甲基化药物地西他滨可显著升高内源性C/EBPα蛋白低表达的NB-4细胞表面ULBP1、ULBP2/5/6、ULBP3、ULBP4的表达,且随着药物浓度的升高而升高。结论:体外及体内实验均证实表观遗传学药物可恢复C/EBPα蛋白低表达的AML细胞表面的ULBPs表达升高,提高对NK杀伤的敏感性,LSD1抑制剂在通过增强NK细胞对AML细胞的杀伤能力,从而治疗AML方面具有巨大应用前景。