目的: 扩增耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)基因,构建pET-SOD重组子,实现Mn-SOD在大肠杆菌中的高效表达,通过金属离子亲和层析纯化表达蛋白,并对纯化蛋白的性质进行初步研究,为后续探讨耐辐射奇球菌的耐辐射机制以及对SOD的开发应用奠定基础。 方法: 本研究分为三部分: 1.耐辐射奇球菌锰超氧化物歧化酶基因原核表达载体的构建:用PCR方法自D.radiodurans基因组中扩增Mn-SOD目的片段。将该基因与原核表达质粒载体pET-30a(+)连接,构建重组质粒pET-SOD,并转化克隆宿主菌E.coli DH5α,利用卡那霉素抗性筛选阳性克隆,质粒小量提取后,双酶切和基因序列测定鉴定重组质粒。 2.超氧化物歧化酶融合蛋白的表达及纯化:重组质粒pET-SOD转化表达宿主菌E.coli BL21(DE3),IPTG诱导SOD融合蛋白表达,SDS-PAGE分析目的蛋白表达情况:通过镍金属离子亲和层析对SOD融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE检测蛋白纯度和亚基分子量。 3.超氧化物歧化酶融合蛋白的性质研究:包括纯化产物总蛋白含量测定,SOD活性测定,SOD种类鉴定,SOD紫外吸收光谱测定,SOD的pH稳定性、温度稳定性研究。