研究背景高血压作为心脑血管疾病发生的主要致病因素,同时也是导致肾脏发生损伤的重要原因。高血压肾病（Hypertensive Renal Disease,HRD）是由原发性高血压导致的肾脏结构和功能的损害,是内科常见疾病之一,但其发病机制尚未完全清楚。高血压肾损害主要表现为蛋白尿增多、良性肾小球硬化、肾脏间质纤维化以及炎症细胞浸润。肾小管及间质的纤维化、炎症和免疫激活是导致HRD持续进展的重要因素。细胞外基质蛋白合成及其降解之间的平衡受损造成过量的基质沉积,这是纤维化过程的一个典型特征。炎症因子的分泌以及炎症细胞的浸润是肾脏纤维化的始动因素。目前还没有有效的方法可预防纤维化的进展,因此提高对HRD纤维化和炎症进展的细胞及分子机制的认识至关重要。目前研究中常见的HRD发病机制有遗传因素、盐敏感、氧化应激、内皮细胞功能障碍以及肾素-血管紧张素醛固酮系统（Renin-Angiotensin-Aldosterone System,RAAS）的激活。抑制RAAS的过度激活是目前减缓肾脏疾病进展的最有效的方法。血管紧张素Ⅱ（Angiotension Ⅱ,AngⅡ）作为RAAS的主要效应因子,主要通过血流动力学和非血流动力学两方面参与血压和靶器官损害的调节。它可作用于肾脏血管平滑肌细胞,导致血管收缩;它也可作为促炎剂,激活细胞内信号传导系统,促进肾脏的炎症反应;而且它可通过上调转化生长因子β1（Transforming growth factor-beta 1,TGF-β1）的表达、增加成纤维细胞增殖,促进细胞外基质的合成、抑制细胞外基质的降解,加速肾脏纤维化的过程。因此,AngⅡ是HRD进展中的关键调节因子。泛素化修饰作为一种常见的蛋白质翻译后修饰,不仅是蛋白酶体降解目的蛋白的标记,也是蛋白-蛋白相互作用和酶激活的调节因素。目前研究发现多种E3泛素连接酶可调控高血压及其靶器官的损害,但针对高血压肾损伤的泛素化修饰研究还鲜有报道。发现调控HRD的新型E3泛素连接酶及探寻其调控机制,将为阐述HRD发病机制及研发HRD药物提供良好的理论基础,这也成为当前该领域的热点问题。TRIM（The tripartite motif）31属于TRIM家族的一员,也是一个非常重要的E3泛素连接酶,其是否同样在高血压及HRD中发挥重要作用尚未报道。既往研究表明,TRIM31在多种疾病发展中发挥着关键的调控作用,尤其是在肿瘤的增殖、迁移过程中,机制方面主要涉及到TRIM31调控核因子κB（Nuclear factor kappa-B,NF-κB）的活化参与炎症反应。因NF-κB的活化在HRD的病理进展中发挥着至关重要的作用,提示TRIM31可能同样参与到HRD疾病的发生和发展中。在本实验中,我们提出以下科学假设:在AngⅡ构建的HRD小鼠模型中,E3泛素化连接酶TRIM31可改善肾脏功能、纤维化和炎症反应。为了验证以上假说,我们精心设计了一系列的体内和体外实验。研究目的1.探讨TRIM31与人和小鼠HRD病理进展的相关性;2.探讨TRIM31是否参与调节HRD小鼠的肾脏功能损害;3.探讨TRIM31是否参与调节HRD小鼠的肾脏纤维化;4.探讨TRIM31是否参与调节HRD小鼠的肾脏炎症反应。研究方法1.实验动物利用 TALEN（Transcription activator-like effectors Nucleases）技术构建TRIM31基因敲除（TRIM3 1-/-）小鼠,小鼠背景为C57BL/6J。与野生型C57BL/6J小鼠杂交扩繁,得到同窝纯合野生型C57BL/6J（TRIM31+/+）小鼠和TRIM31-/-小鼠。野生型C57BL/6J小鼠购买于维通利华（北京）实验动物技术有限公司。所有动物实验均遵循国家卫生部动物管理办法（documentation No 55,2001）,同时遵守山东大学齐鲁医院伦理委员会对动物实验的要求和规定。2.实验动物分组（1）选取8周龄雄性野生型（Wildtype,WT）C57BL/6J小鼠,随机分成两组,每组15只:生理盐水组,AngⅡ组。（2）分别选取8周龄雄性TRIM31-/-小鼠和同窝雄性TRIM31+/+小鼠,随机分为四组,每组15只:TRIM31+/++生理盐水组,TRIM31-/-+生理盐水组,TRIM31+/++AngⅡ 组,TRIM31-/-+AngⅡ 组。3.HRD小鼠模型的建立预先将微量渗透泵灌注适当剂量AngⅡ分别埋入8周龄雄性小鼠的背侧皮下,以泵速1000ng/kg/min持续泵入AngⅡ 42天,构建高血压小鼠模型,对照组泵入同等体积的无菌生理盐水（每组15只）。分别于造模前和造模后每周定时测量小鼠血压、体重,并留取小鼠24h尿液。实验结束时,将小鼠进行安乐死,测量体重及左右肾重,并留取小鼠血液、肾脏、心脏、肝脏、小肠等组织标本进行下一步组织和细胞分子学研究。4.临床高血压肾病患者肾活检标本收集和检测我们从山东大学病理学教研室获得行肿瘤切除术的无高血压患者的正常癌旁肾组织（Control）、无高血压的肾小球轻微病变（Glomerular minor lesion,GML）患者肾脏活检组织、HRD患者肾脏活检组织样本。利用免疫组化（immunohistochemistry,IHC）检测TRIM31蛋白的表达情况,同时利用苏木素-伊红染色（Hematoxylin andeosin,HE）和 Masson’s trichrome 染色探讨 TRIM31蛋白表达与肾脏损伤和纤维化程度的相关性。5.小鼠基因型鉴定利用鼠尾提取试剂盒提取小鼠鼠尾DNA,PCR扩增后通过测序对小鼠进行基因型鉴定。同时提取小鼠的肾脏组织蛋白,通过蛋白免疫印迹分析（Western blot）的方法检测TRIM31的蛋白表达水平,评估TRIM31的基因敲除效率。6.细胞培养和处理实验中采用人近端肾小管上皮细胞系（Human proximal renal tubular eβ1thelial cell-2,HK2）,培养在 10%FBS 的 RPMI1640 培养基中,于含 5%CO2 的 37℃孵箱中增殖。主要处理见下:（1）时间浓度实验:选用10-5MAngⅡ分别刺激HK2细胞0,4h,8h,12h,24h,36h,收集细胞。（2）浓度梯度实验:分别选用 0,10-8M,10-7M,10-6M,10-5M,10-4M的 AngⅡ刺激HK2细胞24h,收集细胞。7.小鼠血压测量利用Data Sciences International（DSI）无线遥感测量方法分别于造模前和造模后每周定时测量4组小鼠（TRIM31+/++生理盐水组,TRIM31-/-+生理盐水组,TRIM31+/++AngⅡ 组,TRIM31-/-+AngⅡ 组）的收缩压（Systolic blood pressure,SBP）和舒张压（Diastolic blood pressure,DBP）。8.小鼠组织样本取材分别于造模前和造模后每周定时测量小鼠血压、体重,并留取小鼠尿液进行相关肾脏功能指标检测。实验结束时,将小鼠进行安乐死,并留取小鼠血液、肾脏、心脏、肝脏、小肠等组织标本,对心脏和左右肾脏进行称重,剥除肾脏包膜,依后期实验需求将各个组织放于液氮保存或者放于4%多聚甲醛中固定24-48h或者放于2%戊二醛中固定以待后续实验使用。9.小鼠肾脏功能和24h尿蛋白检测留取小鼠血液和尿液,利用全自动生化仪和ELISA的方法检测TRIM31-/-小鼠与 TRIM31+/+小鼠血清中尿素氮（Blood urea nitrogen,BUN）、肌酐（serum creatinine,Cr）、尿酸（Uric acid,UA）以及24h尿蛋白等主要肾脏功能指标的差异。10.透射电镜（Transmission electron microscope,TEM）观察小鼠肾脏超微结构取4组小鼠的肾脏皮质,利用2.5%的戊二醛固定组织后,利用透射电镜观察4组小鼠的肾小球足突细胞、基底膜等超微结构。11.Meso Scale Discovery（MSD）检测血清中炎症相关指标取的4组小鼠冻存在-80℃冰箱的血清,基于电化学发光的原理,利用预包埋好的MSD多因子检测板和MSD检测器来检测小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β和MCP-1的含量。12.小鼠肾脏组织学和IHC染色将固定在4%多聚甲醛中的4组小鼠肾脏组织脱水包埋成蜡块,制备石蜡切片（厚度:4μm）。通过Masson’s trichrome和天狼猩红染色检测4组小鼠肾脏间质的纤维化情况。过碘酸雪夫氏染色（Periodic acid-schiffstain,PAS）观察小鼠肾脏中肾小球硬化的差异。利用IHC的方法检测4组小鼠肾脏组织中TRIM31、KIM-1、Nephrin、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、Collagen Ⅳ、Fibronectin、α-SMA、CD68、TNF-α、IL-6和IL-1β的表达差异。13.组织RNA提取、反转录和实时荧光定量PCR（Real-time PCR,RT-PCR）提取4组小鼠肾脏组织和HK2细胞的RNA,利用TAKARA反转录试剂盒进行mRNA的反转录,然后通过RT-PCR获得目的基因trim31、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、collagen Ⅳ、fibronectin、α-sma、tnf-α、il-6和il-1β的 Ct 值,利用β-actin作为内参,将所得的Ct值,采用公式（2-ΔΔCT）计算目的分子表达量的的相对变化。14.Western blot 分析利用蛋白提取试剂盒提取4组小鼠肾脏组织蛋白,或利用细胞裂解液提取HK2细胞蛋白,BCA调定蛋白浓度后进行SDS-PAGE凝胶电泳,检测TRIM31、TRIM31、KIM-1、Nephrin、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、Collagen Ⅳ、Fibronectin、Δ-SMA、TNF-Δ、IL-6 和 IL-1β 的蛋白含量。15.数据统计分析方法所有数据分析均使用的GraphPad Prism 8软件,以均数（mean）±标准误（SEM）进行表示。首先采用Shaβ1ro-Wilk检验对数据分布进行正态性假设的评估。对于属于正态分布的单因素数据,两组间的统计差异采用非配对t检验分析,多组间的统计差异采用单因素方差分析。对于具有两个变量的多组数据,验证数据属于正态分布后,使用双因素方差分析进行分析其统计差异。对于不属于正态分布的数据,我们使用的Kruskal-Wallis检验进行非参数统计分析。在所有的统计比较中,p值小于0.05为有统计学意义。研究结果1.在AngⅡ诱导的HRD小鼠模型肾组织中TRIM31的表达量明显下调我们通过在小鼠皮下埋入AngⅡ缓释泵成功构建了 HRD小鼠模型。通过IHC、Western blot和RT-PCR的方法进行检测,发现与生理盐水组对比,AngⅡ组小鼠肾脏的TRIM31表达量明显下调。2.AngⅡ剂量和时间依赖性调控肾小管上皮细胞中TRIM31的表达体外培养的HK2细胞,AngⅡ刺激细胞不同的时间（0,4h,8h,12h,24h,36h）或以不同的浓度（0,10-8 M,10-7M,10-6 M,10-5 M,10-4 M）的 AngⅡ刺激细胞,利用Western blot和RT-PCR的方法进行检测,发现伴随AngⅡ的梯度刺激,TRIM31的表达在蛋白水平和mRNA水平均呈现显著降低。以上体内外实验说明,TRIM31的表达与HRD存在一定相关性,提示我们TRIM31可能参与到HRD疾病进展过程。3.利用TRIM31敲基因小鼠构建AngⅡ诱导的小鼠HRD模型（1）在C57BL/6J的小鼠背景下,利用TALEN技术成功构建TRIM31敲基因小鼠。提取小鼠鼠尾基因组DNA进行鼠尾基因型鉴定,证实了 TRIM31敲基因小鼠成功构建。同时提取TRIM3 1+/+和TRIM3 1-/-小鼠肾脏组织蛋白,利用Western blot的技术进一步验证了 TRIM31敲基因小鼠中TRIM31的蛋白敲除效率。（2）测量4组小鼠（TRIM31+/++生理盐水组,TRIM3 1-/-+生理盐水组,TRIM31+/++AngⅡ组,TRIM3 1-/-+AngⅡ组）造模前后的体重和取材后左右肾重量,发现TRIM31基因敲除并不影响小鼠的肾重/体重比。4.TRIM31基因缺失不影响AngⅡ诱导的小鼠血压的改变利用DSI遥感法对4组小鼠的SBP及DBP进行测量,结果显示,与生理盐水组对比,AngⅡ组小鼠血压在泵入后第一周起即出现明显升高,并在接下来的几周持续在较高水平。DSI测量结果显示AngⅡ组小鼠造模结束前最后一周血压均大于140mmHg,达到高血压的水平,证实了小鼠高血压模型构建成功。然而在泵入生理盐水或者AngⅡ后,TRIM31+/+与TRIM31-/-两组小鼠间无明显血压改变。以上结果说明,TRIM31基因缺失不影响小鼠血压的基线水平,也不影响影响AngⅡ诱导的小鼠血压的改变。5.TRIM31基因缺失加重AngⅡ诱导的高血压肾功能损伤小鼠血清Cr、BUN和24h尿蛋白的测量表明,AngⅡ诱导的HRD小鼠出现了肾功能的损伤和小鼠肾滤过屏障的损害,而TRIM31基因缺失进一步加重了AngⅡ诱导的HRD小鼠的肾损伤。肾脏Nephrin、KIM-1的Western blot和IHC染色提示,TRIM31基因敲除加重了 AngⅡ引起HRD小鼠的肾小管的损伤和肾脏足突细胞的损害。同时PAS染色表明,AngⅡ诱导的HRD小鼠的发生了肾小球硬化,TRIM31基因敲除进一步加重HRD小鼠的肾小球硬化。此外,TEM检测发现TRIM31基因敲除后明显加AngⅡ诱导的HRD小鼠肾脏的足突和基底膜的损害。以上说明TRIM31基因缺失明显加重了 HRD小鼠的肾功能损伤。6.TRIM31基因缺失加重AngⅡ诱导的高血压肾纤维化Masson’s trichrome和天狼猩红染色显示,AngⅡ诱导的HRD小鼠的肾脏呈现明显的纤维化,并且TRIM31-/-小鼠较TRIM31+/+小鼠更严重。Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、Collagen Ⅳ、纤连蛋白（Fibronectin）和促纤维化因子 α-smooth muscle actin（α-SMA）的 IHC、Western blot、RT-PCR 实验显示在泵入 AngⅡ后,与TRIM31+/+对比,TRIM3 1-/小鼠的以上纤维化指标表达明显增加。提示TRIM31基因缺失可明显加重AngⅡ诱导的高血压肾纤维化。7.TRIM31基因缺失加重AngⅡ诱导的HRD小鼠肾脏的炎症反应利用MSD多因子检测技术检测4组小鼠（TRIM31+/++生理盐水组,TRIM31-/-+生理盐水组,TRIM3 1+/++AngⅡ组,TRIM31-/-+AngⅡ组）血清中炎症相关指标,结果显示泵入AngⅡ后,小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-iβ的表达量明显增加,与TRIM31+/+小鼠对比,TRIM31-/-小鼠增加的更为显著。利用巨噬细胞表面Marker CD68抗体对4组小鼠肾脏进行IHC染色,结果显示泵入AngⅡ后,巨噬细胞浸润明显增加,与TRIM31+/+小鼠对比,TRIM31-/-进一步加重了HRD小鼠的肾脏组织中巨噬细胞的浸润。同时IHC、Western blot和RT-PCR的方法检测4组小鼠肾脏炎症指标表达量,结果同样提示与TRIM31+/+小鼠对比,TRIM31基因敲除后明显增强小鼠肾脏组织中炎症相关分子TNF-α、IL-6、IL-1β的表达。8.TRIM31在HRD患者肾活检组织中的表达明显下降利用IHC的检测方法,我们发现与非高血压患者的正常癌旁肾组织Control和非高血压的GML活检肾组织相比,HRD患者的肾组织切片中TRIM31的表达量明显下调。实验结论1.TRIM31在HRD的病理组织中蛋白表达量降低。2.TRIM31基因缺失明显加重了小鼠高血压肾功能损害、纤维化和炎症反应。研究背景炎症和纤维化是高血压肾病（Hypertensive Renal Disease,HRD）的两个主要病理特征,血管紧张素Ⅱ（AngiotensionⅡ AngⅡ）在诱发肾脏组织发生炎症和纤维化的过程中发挥着关键作用。转化生长因子β1（Transfoiming growth factor-beta 1,TGF-β1）是HRD炎症、纤维化发病机理中的主要调控因子。TGF-β1可诱导细胞外基质（Extracellular Matrix,ECM）的生成和沉积、促进成纤维细胞的增殖和分化和上皮细胞的转分化等病理过程。机制方面,TGF-β1主要通过介导Smad依赖的信号通路和非Smad依赖的信号通路（主要是MAPKs和NF-kB信号通路）的活化来调控肾脏纤维化及肾脏炎症,靶向抑制TGF-β1下游信号通路的激活对HRD的治疗具有重大意义。研究显示,Angll可诱导肾脏过度分泌TGF-β1等细胞因子,并进一步通过TGF-β1加重高血压肾损伤。探讨TGF-β1信号通路的调控机制,有利于进一步阐明高血压肾病的发病原因,并为高血压肾病药物研发提供理论依据。TGF-β-activated kinase 1（TAK1）是一种丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶（Mitogen-activated protein kinase kinase kinase,MAP3K）。TAK1的激酶活性受到TGF-β1等多种细胞因子的调控。研究显示,活化的TAK1进一步磷酸化TGF-β1信号通路下游关键接头蛋白,在非Smad依赖的信号通路（主要是MAPKs和NF-kB）的活化及炎症因子的产生过程中发挥着关键作用。然而,在HRD发生发展过程中,TAK1是否同时参与调控TGF-β1介导的经典Smad信号通路及肾脏纤维化进展仍有待进一步的研究阐明。泛素化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰,是泛素本身通过7个内部的赖氨酸（K6、K11、K27、K29、K33、K48和K64）形成多聚泛素链。E3泛素连接酶决定了泛素分子结合到靶蛋白的特异性,因此也是蛋白质泛素过程中最关键的分子。蛋白质泛素化修饰在多种疾病发生发展过程中发挥着关键作用。研究蛋白质泛素化修饰调控HRD发生的分子机制,并寻找新型治疗靶点具有重要的科学意义和临床价值。已有文献报道,蛋白泛素化修饰在TGF-β1下游信号转导以及TAK1生物学功能的发挥着重要的作用,然而相关的E3泛素连接酶有待进一步的发现。在我们第一部分研究中已证实The tripartite motif 31（TRM31）参与并调控HRD小鼠肾功能损伤、纤维化和炎症反应。TRIM31是否通过调控TGF-β1信号通路在HRD中发挥作用,以及具体的分子机制有待进一步研究。因此,我们在本研究中提出了以下科学假说:TRIM31可通过泛素化修饰TGF-β1信号通路中的靶蛋白,从而参与到TGF-1P相关信号通路在HRD中的激活,进而在HRD病理进程中发挥保护作用。在本研究中,我们将通过体内和体外实验研究进一步探讨TRIM31在HRD中发挥作用的分子机制,为高血压肾损害的治疗寻找新的靶点。研究目的1.探讨在HRD病理进展中TRIM31对TGF-β1信号通路活化的影响;2.探讨TGF-β1信号通路TRIM31的靶分子;3.探讨TRIM31对靶分子的泛素化修饰情况;4.探讨TAK1在TGF-β1信号通路中的作用。研究方法1.实验动物分组分别选取8周龄雄性TRIM31-/-小鼠和同窝雄性TRJM31+/+小鼠,随机分为四组,每组15只:TRIM31+/++生理盐水组,TRIM31-/-+生理盐水组,TRJM31+/++AngⅡ组,TRIM31-/-+AngⅡ组。2.HRD小鼠模型的建立将预先灌注好AngⅡ的微量渗透泵,分别埋入小鼠的背侧皮下,按照以1000ng/kg/min的泵速持续泵入AngⅡ42天,构建HRD小鼠模型,对照组泵入同等体积的无菌生理盐水。实验结束时,将小鼠进行安乐死,并留取小鼠肾脏进行下一步组织和细胞分子学研究。3.临床髙血压肾病患者肾活检标本收集和检测我们从山东大学病理学教研室获得行肿瘤切除术的无高血压患者的正常癌旁肾组织（Control）、无高血压的肾小球轻微病变（Glomerular minor lesion,GML）患者肾脏活检组织、HRD患者肾脏活检组织样本。利用免疫组化（immunohistochemistry,IHC）检测TGF-β1、Collagen Ⅰ、pSmad3、TAK1、TNF-a、pP65的表达情况。4.细胞培养和处理实验中采用人近端肾小管上皮细胞系（Human proximal renal tubular eβ1thelial cell-2,HK2）、小鼠原代肾小管上皮细胞（Mouse Primary renal tubular eβ1thelial cells,MRPTEβ1C）、人胚肾细胞（HEK-293T）,分别培养在含10%FBS的RPMI1640、高糖DMEM培养基和Eβ1CM-A培养基中,于含5%CO2的37°C孵箱中增殖。主要处理见下:（1）HK2细胞处理:1)选择hTGF-β1作为HRD体外刺激因子。体外培养HK2细胞,给予不同浓度的hTGF-β1（0,2ng/mL,4ng/mL,6ng/mL,8ng/mL,10ng/mL）刺激24h或以10ng/mL的hTGF-β1刺激不同时间（0,4h,8h,12h,24h,36h）,收集细胞;2)体外培养HK2细胞,给予TGF-β1中和抗体预处理后,以10-5 M浓度的AngⅡ刺激HK2细胞时间梯度（0,4h,8h,12h,24h,36h）,提取细胞蛋白;3)体外培养HK2细胞,利用RNAiMAX转染细胞TRIM31的小干扰RNA敲减TRIM31的表达,使用10ng/mL的hTGF-β1刺激细胞0、12h或24h,提取细胞蛋白;4)将构建的将Flag标签的TRIM31-WT、缺失突变体TRIM31-ΔRing以及点突变TRIM31-C53A/C56A过表达质粒利用Lipo3000转染试剂分别转染体外培养的HK2细胞,并利用10ng/mL hTGF-β1刺激细胞0或24h,提取细胞蛋白,进行Western blot实验;5)体外培养HK2细胞,lOng/mLhTGF-β1刺激0.5h或lh后,提取细胞蛋白,进行Western blot或免疫共沉淀实验（Co-immunopreciβ1tation,Co-IP）实验;6)体外培养HK2细胞系,利用TAK1的特异性抑制剂5z-7-oxozeaenol（5z7）抑制TAK1的激酶活性,或利用TAK1的小干扰RNA敲减TAK1的蛋白表达,使用10ng/mLhTGF-β1刺激细胞0.5h和lh后,提取细胞蛋白。（2）MRPTEpiC细胞处理:体外培养MRPTEpiC细胞,利用TAK1的特异性抑制剂5z7抑制TAK1的激酶活性,或者利用TAK1的小干扰RNA敲减TAK1的蛋白表达,使用10ng/mL hTGF-β1刺激细胞0.5h和lh后,提取细胞蛋白。（3）HEK-293T细胞处理:1)将TRAF6、TAK1、Smad2、Smad3及Smad4的过表达质粒,与TRIM31过表达质粒分别共转染入HEK293T细胞系。提取细胞蛋白进行Co-IP实验;2)将GFP标签的TRIM31和Myc标签的TAK1过表达质粒共转染HEK293T细胞系,进行细胞免疫荧光染色;3)将TRIM31不同的截断突变体（TRIM31-ΔRing,TRIM31-AB,TRIM31-AC-C,TRIM31-AC）和TAK1的不同截断突变体（l-300aa,l-480aa,30I-579aa）,分别与野生型TAK1或者野生型TRIM31过表达质粒共转染入HEK293T细胞系,提取细胞蛋白进行Co-IP实验;4)将不同浓度的Flag-TRIM31过表达质粒与相同浓度Myc-TAKl过表达质粒共转染HEK293T细胞系,提取细胞蛋白;5)将Flag-TRIM31与Myc-TAKl过表达质粒共转染HEK293T细胞系后培养24h,提取细胞蛋白前4h分别加入蛋白酶体途径抑制剂Bortezomib和溶酶体途径抑制剂氯喹（chloroquine）,提取细胞蛋白;6)将Flag标签的TRIM31-WT、TRIM31-ARing以及TRM31-C53A/C56A与Myc-TAKl过表达质粒共转染HEK293T细胞系24h,提取细胞蛋白;7)将HA标签的不同类型（WT、K48或K63）泛素过表达质粒,与Flag-TRIM31、Myc-TAKl过表达质粒共转染HEK293T细胞系24h,提取细胞蛋白,进行CO-1P实验;8)将TAK1赖氨酸点突变过表达质粒Myc-TAK1-K72R、Myc-TAK1-K158R,分别与Flag-TRIM31和HA标签的泛素过表达质粒共转染HEK293T细胞系,24h后提取蛋白,进行CO-IP实验。5.小鼠组织样本取材造模结束后将小鼠进行安乐死,留取小鼠肾脏标本,剥除肾脏包膜后,分别放于液氮保存或者放于4%多聚甲醛中固定2448h以待后续实验使用。6.小鼠肾脏组织制备和IHC染色将固定在4%多聚甲醛中的4组小鼠肾脏组织脱水包埋成蜡块,制备石蜡切片（厚度:4pn）。利用IHC染色的方法检测4组小鼠肾脏组织中TGF-β1的表达差异。7.组织RNA提取、反转录和实时荧光定量（Real-time PCR,RT-PCR）提取4组小鼠肾脏组织和HK2细胞的RNA,利用TAKARA反转录试剂盒进行mRNA的反转录,然后通过RT-PCR获得目的基因八Ⅰ、collagen Ⅲ、collagen Ⅳ、Jibronectin、a-sma、tnf-a、il-6和il-1β办的Ct值,利用P-actin作为内参,将所得的Ct值,采用2-AACT公式计算目的分子的相对表达量的变化。8.Western blot分析利用蛋白提取试剂盒提取4组小鼠肾脏组织蛋白,或利用细胞裂解液提取HK2、HEK293T或MRPTEβ1C细胞蛋白,BCA调定蛋白浓度后进行SDS-PAGE凝胶电泳,检测各个目的分子的蛋白含量。9.激光共聚焦检测TRIM31与TAK1的共定位将GFP标签的TRIM31和Myc标签的TAK1过表达质粒共转染HEK293T细胞系,细胞免疫荧光染色后,利用激光共聚焦显微镜检测TRIM31与TAK1在细胞内的共定位情况。10.表达载体和点突变的构建通过目的基因的引物设计、扩增、酶切和连接等步骤进行重组质粒和点突变质粒的构建和抽提,用于进一步的过表达和体外转录翻译实验。11.免疫共沉淀魏（Co-IP）体外培养HK2,利用内源性抗体进行Co-IP检测内源性目的分子的结合。体外培养HEK293T细胞,并构建各种目的分子的过表达质粒转染细胞,利用标签抗体进行Co-IP检测内源性目的分子的结合。体外翻译系统表达目的分子蛋白,利用标签抗体进行Co-IP检测目的分子的外源性结合。12.细胞转染体外培养HK2、HEK293T或MRPTEβ1C细胞,将TRIM31或TAK1的小干扰RNA利用RNAiMAX转染细胞,敲减目的基因的表达。将过表达质粒利用Lip3000转染细胞进行目的基因的过表达。13.体外翻译系统进行体外蛋白表达实验构建含有T7启动子的PCDNA3.1过表达质粒,利用Promega公司的TNT Quick Coupied Transcription/translation System试剂盒进行网织红细胞体外转录翻译系统,或者利用Mini Expression Module试剂盒进行大肠杆菌体外翻译对TAK1和TRIM31等表达质粒进行体外转录翻译。14.体外泛素化修饰实验将体外翻译系统获得的蛋白加入BostonBiochem公司的体外泛素修饰系统（包含有El,UbcH5a,K48,K63等蛋白）,室温反应30分钟后,利用Western blot的方法检测体外泛素化修饰的情况及泛素化修饰的类型。15.数据统计分析方法所有数据使用GraphPad Prism 8软件进行分析,表示为均数（mean）土标准误（SEM）。采用Shapiro-Wilk检验进行数据分布的正态性假设的评估。采用非配对t检验分析正态分布的单因素数据中两组间的统计差异,采用单因素方差分析分析正态分布的的多组间的统计差异。对于具有两个变量的多组数据,验证数据属于正态分布后,使用双因素方差分析进行分析其统计差异。不属于正态分布的数据,使用Kruskal-Wallis检验进行非参数统计分析。在所有的统计比较中,p值小于0.05为有统计学意义。研究结果1.TGF-β1参与了AngⅡ诱导的小鼠高血压肾损害TGF-β1是高血压肾损伤和肾小管间质纤维化的关键细胞因子。Western blot、IHC和RT-PCR检测发现,TGF-β1在AngⅡ诱导的小鼠HRD的肾脏组织中的表达量明显增加,说明TGF-β1参与了HRD的疾病进展。同时,TGF-β1的表达量在TRIM31+/+和TRIM31I小鼠之间没有统计学差异,说明TRIM31的基因敲除并不影响TGF-β1在HRD肾脏中的表达量。2.TGF-β1抑制TRIM31的蛋白表达Western blot及RT-PCR结果显示,伴随hTGF-β1刺激HK2细胞不同时间或利用不同浓度的hTGF-β1刺激细胞,肾小管上皮细胞中TRIM31的表达均呈现显著降低。这些结果说明TGF-β1抑制TRIM31基因的转录和翻译,并提示TRIM31可能参与TGF-β1介导的信号通路。而在给予TGF-β1中和抗体预处理的情况下,Angll导致TRIM31蛋白水平下降的情况得以恢复。以上提示TGF-β1负向调控TRIM31的蛋白表达,而Angn对TRIM31的蛋白表达调控可能是通过TGF-β1发挥的。3.TRIM31负调控hTGF-β1介导的肾小管上皮细胞的纤维化及炎症反应Western blot和RT-PCR检测结果显示,TRIM31基因敲减能明显加重hTGF-β1诱导的肾小管上皮细胞纤维化进程和炎症相关指标的表达。野生型TRIM31基因过表达可明显改善hTGF-β1诱导的肾小管上皮细胞的纤维化进程和炎症相关指标的表达。而过表达缺失E3泛素连接酶活性的TRIM31 Ring结构域缺失突变体TRIM31-ARing以及E3泛素连接酶活性缺失点突变过表达质粒TRIM31-C53A/C56A不影响hTGF-β1诱导的肾小管上皮细胞的纤维化进程和炎症相关指标的表达。以上结果说明,TRIM31通过其E3泛素连接酶活性抑制hTGF-β1诱导的肾小管上皮细胞的纤维化进程和炎症反应。4.TRIM31介导了TGF-β1信号的通路活化经典Smad信号通路以及非Smad信号通路在肾脏纤维化过程中发挥着重要作用,其中Smad2、Smad3的磷酸化代表经典Smad信号通路活化,ERK、JNK、P38、NF-κB的磷酸化代表非Smad信号通路的活化。提取4组小鼠(TRIM31+/+生理盐水组,TRIM31-/+生理盐水组,TRIM31+/++AngⅡ组,TRIM31-/-+AngⅡ组)肾脏蛋白,Western blot检测显示,相比野生型小鼠HRD肾脏组织,TRIM31-/-HRD小鼠肾脏组织中Smad2、Smad3、ERK、JNK、P38、NF-κB磷酸化明显升高。体外培养HK2细胞,发现TRIM31基因敲减同样能明显增强TGF-β1诱导的经典Smad信号通路以及非Smad信号通路的活化水平。以上结果说明TRIM31可负向调控TGF-β1信号通路的活化水平。5.明确了TGF-β1信号通路中TRIM31的靶分蛋白前期结果表明TRIM31可调控TGF-β1介导的信号通路,我们将重点寻找该信号通路中TRIM31作用的靶蛋白。将TGF-β1信号通路中关键接头分子TRAF6、TAK1、Smad2、Smad3及Smad4等的过表达质粒与TRIM31过表达质粒分别共转染入HEK293T细胞系。利用Co-IP实验检测发现TRIM31与TRAF6、TAK1发生了明显的结合。同时体外培养HK2细胞,hTGF-β1刺激不同时间点后,利用TRIM31特异性抗体进行Co-IP实验,同样检测到了内源性TRIM31与TAK1、TRAF6的结合,同时发现伴随着hTGF-β1刺激时间的增加,HK2细胞中TRIM31与TAK1的结合呈现增多的趋势。以上结果提示TAK1、TRAF6可能是TGF-β1信号通路中TRIM31调控的靶分子。6.TRIM31靶向降解TAK1将浓度梯度的TRIM31过表达质粒与TRAF6或TAK1过表达质粒分别共转染HEK293T细胞系,利用Western blot的方法检测到TRIM31可降低TAK1蛋白表达量,并且存在浓度梯度依赖性。然而,TRM31的过表达并不影响TRAF6的蛋白表达量。我们同时发现,转染TRIM31-ARing以及TRIM31-C53A/C56A过表达质粒不影响TAK1的蛋白表达量。以上结果说明,TRIM31可通过其E3泛素连接酶活性特异性降解TAK1,而对TRAF6的蛋白表达无影响。至此,我们确定TAK1为TGF-β1信号通路中TRIM31的结合及降解靶点。7.TRIM31对TAK1进行了蛋白酶体途径的降解泛素-蛋白酶体途径和自噬-溶酶体途径是体内蛋白质发生降解的主要途径。我们将Flag标签的TRIM31过表达质粒与Myc标签的TAK1过表达质粒共转染HEK293T细胞系,培养24h后分别加入蛋白酶体途径抑制剂Bortezomib和溶酶体途径抑制剂chloroquine处理4h,提取细胞蛋白,利用Western blot的方法检测到蛋白酶体抑制剂Bortezomib可恢复TRIM31介导的TAK1降解,而溶酶体抑制剂chloroquine对TRIM31介导的TAK1降解无影响。以上说明TRIM31通过蛋白酶体途径介导TAK1的降解。8.TRIM31与TAK1在细胞浆中共定位将GFP标签的TRIM31和Myc标签的TAK1过表达质粒共转染HEK293T细胞系,细胞免疫荧光染色后,利用激光共聚焦显微镜检测发现TRIM31与TAK1在细胞中存在明显的共定位。9.TRIM31与TAK1体外结合利用大肠杆菌和网织红细胞体外翻译系统分别获得TRIM31和TAK1的体外表达蛋白,利用glutathione S-transferase（GST）pull-down实验和Co-IP的方法检测到体外表达的TRIM31与TAK1蛋白可发生直接结合。10.TRIM31与TAK1发生结合的结构域通过构建一系列TRIM31与TAK1的关键结构域截断突变体,共转染HEK293T细胞系,Co-IP实验表明TRIM31的130-425氨基酸序列与TAK1的1-300氨基酸序列分别在TRIM31与TAK1的结合中发挥着重要作用。11.TRIM31对TAK1进行了泛素化修饰前期结果证明TRIM31介导了TAK1蛋白酶体途径的降解,TRIM31作为E3泛素连接酶家族的一员,我们进一步探索了TRIM31是否是通过泛素化修饰TAK1进而介导其发生蛋白酶体途径降解。将泛素过表达质粒、TRIM31过表达质粒、TAK1过表达质粒共转染HEK293T细胞系,Co-IP实验表明TRIM31明显促进了TAK1的泛素化修饰,过表达泛素连接酶活性关键结构域缺失突变体TRIM31-ARing以及泛素连接酶活性缺失点突变体TRIM31-C53A/C56A则没有此作用,说明TRIM31可促进TAK1的泛素化修饰,这一作用与TRIM31的E3泛素连接酶功能密切相关。作为对照,TRM31并不能促进接头分子TRAF6的泛素化修饰。12.证明TRIM31促进TAK1进行了K48位泛素化修饰前面验证了TRIM31可对TAK1进行泛素化修饰,为进一步探索TRIM31对TAK1进行泛素化修饰的类型,我们分别将不同类型（WT、K48或K63）的泛素过表达质粒,与TRIM31过表达质粒、TAK1过表达质粒共转染HEK293T细胞系,泛素化实验表明TRIM31可明显促进TAK1 K48位的泛素化修饰。同时培养HK2细胞系,利用TRIM31小干扰RNA敲减TRIM31的表达,hTGF-β1刺激后,提取细胞蛋白,利用TAK1特异性抗体进行Co-IP,结果显示TRIM31同样可介导内源性TAK1蛋白的K48位的泛素化修饰。13.发现了TRIM31对TAK1进行泛素化修饰的具体位点为了进一步探索TRIM31对TAK1上哪个赖氨酸位点进行了泛素化修饰,我们通过查阅文献发现TAK1上第158位赖氨酸位点和第72位赖氨酸位点可能发生泛素化修饰,但调控这2个位点进行修饰的E3泛素连接酶却一直没有被发现。我们进一步构建了K158位和K72位赖氨酸突变的TAK1过表达质粒,分别与TRIM31过表达质粒和K48泛素过表达质粒共转染HEK293T细胞系,通过泛素化实验检测发现TRIM31可对TAK1第72位赖氨酸进行了K48位的泛素化修饰。14.利用体外蛋白拥译系统和体外泛素化系统验证了TRIM31对TAK1的泛素化修饰为了进一步探索TRIM31是否直接对TAK1进行泛素化修饰,我们将TAK1和TRIM31分别构建到含有T7启动子的PCDNA3.1-Myc过表达质粒上和含有T7启动子的PCDNA3.1-Flag过表达质粒上,然后利用Promega公司的TNT体外转录翻译系统对TAK1和TRIM31的表达质粒进行体外转录翻译,将翻译后的蛋白加入BostonBiochem公司的体外泛素化修饰系统,利用Western blot的方法进一步证明了TRM31对TAK1进行了K48位的泛素化修饰。同时构建只保留K72位赖氨酸残基（Myc-TAK1-K72）和只突变掉K72赖氨酸残基（Myc-TAK1-K72R）的TAK1的点突变过表达质粒,并进行体外转录翻译得到Myc-TAKl、Myc-TAK1-K72、Myc-TAK1-K72R、FIag-TRIM31的蛋白,然后加入体外泛素化修饰系统,同样发现TRIM31只对含有K72位赖氨酸残基的TAK1进行泛素化修饰。以上结果共同说明了TRIM31可直接对TAK1的第72位赖氨酸进行K48位的泛素化修饰。15.TAK1介导了TGF-β1信号通路的活化体外培养HK2细胞系以及小鼠原代肾小管上皮细胞MRPTEβ1C,利用TAK1的抑制剂5z7抑制TAK1的激酶活性或者利用Si-RNA敲减TAK1的表达后,hTGF-β1介导的Smad2、Smad3、ERK、JNK、P38、NF-kB磷酸化表达水平均明显下降。以上说明,在肾小管上皮细胞中,TAK1同时参与调控TGF-P1信号通路中经典Smad信号通路以及非Smad信号通路的活化。16.临床患者TAK1、炎症、纤维化和TGF-β1信号通路与HRD的相关性从山东大学病理学教研室获得行肿瘤切除术的无高血压患者的正常癌旁组织、无高血压的GML患者肾活检组织、HRD患者肾活检组织切片,并进行IHC检测。结果发现纤维化水平代表性指标Collagen Ⅰ、炎症水平代表性指标TNF-α、TGF-β1信号通路活化代表指标（TGF-β1、pSmad3、pP65）、以及TAK1的表达在HRD活检组织样本中明显增加。这些结果进一步提示我们,TAK1在HRD肾脏纤维化、炎症反应及疾病进展中可能发挥着重要作用。同时,伴随HRD疾病进展,TRIM31表达逐渐降低可能是导致TAK1表达升高及HRD疾病加重的重要原因。实验结论1.TRIM31参与了TGF-β1介导的肾脏纤维化和炎症反应;2.TRIM31通过靶向调控TAK1 K48位的泛素化修饰和蛋白酶体途径的降解进而负调控TGF-β1下游经典Smad信号通路以及非Smad信号通路的活化,最终改善高血压肾损害。