LBD（Lateral Organ Boundaries Domain）蛋白是一类植物特有的转录因子,在植物的生长发育、代谢及防御等过程中均起着重要的调控作用。LBD家族成员众多,在拟南芥中共鉴定到43个LBD蛋白。前人研究表明拟南芥LBD6对侧生器官的发生、器官的极性建立及花粉的正常发育等有重要的调控作用;其在水稻中的同源基因Os AS2的过表达能抑制水稻芽的分化,促进细胞分裂;其在玉米中的同源基因RAMOSA2,决定玉米分枝分生组织细胞的命运;其在大麦中的同源基因Vrs4,控制大麦小穗的形成和排列方式。因此,推测其同源基因在树木的生长发育过程中也起到重要的调控作用。红豆杉（Taxus chinensis）是重要的药用木本植物,有关生长发育调控因子的研究对其遗传改良有重要理论研究意义。TcLBD6是本课题组从红豆杉树皮中克隆到的一个LBD6的同源基因,但其功能尚不清楚。为了进一步研究TcLBD6转录因子在树木生长发育过程中的作用,本文构建了红豆杉TcLBD6编码基因的过表达载体,并转化84K（Populus alba×Populus glandulosa）杨,对过表达及对照植株进行了表型分析。鉴于叶片的表型差异最明显,对过表达及对照植株的叶片进行了代谢组、转录组、蛋白质组等多组学比较分析,并对TcLBD6作用机制进行了初步探讨,重点从下游代谢物层面分析了TcLBD6影响树木叶片生长发育的机制。此外,鉴于代谢组分析显示花青素在TcLBD6异源过表达84K中显著上调,在红豆杉中鉴定了25个与花青素合成相关的基因,并进行了启动子结合预测和表达模式分析。这些结果为今后进一步深入研究红豆杉TcLBD6参与树木生长发育、次生代谢调控的分子机理及红豆杉中多种药用成分开发奠定了理论基础。主要研究结果如下:（1）构建了红豆杉TcLBD6过表达载体并异源转化84K杨,得到了稳定表达的3个转基因株系TcLBD6-oe。表型分析结果表明,典型的TcLBD6-oe植株与对照WT-84K相比,植株生长受到抑制,其中叶片的表型差异最大,具体表现为叶片变小甚至收缩成针状,叶长、叶宽分别为对照植株的35%和2%,叶片维管组织分布分散,未见明显的栅栏组织结构,远轴面出现类似于栅栏组织的细胞。这些结果说明,红豆杉TcLBD6过表达对叶片的生长发育有显著的抑制作用。（2）为了比较异源过表达与同源过表达产生的植株表型差异,克隆并构建了84K杨中与TcLBD6同源性较高的Pag LBD6、Pag LBD25和Pag LBD36基因及其过表达载体,并转化84K杨,得到了Pag LBD6的同源过表达植株Pag LBD6-oe,其表型为植株矮小、叶片缩小,与TcLBD6-oe的叶片表型类似,说明TcLBD6对叶片发育的抑制作用是该基因本身的作用,与其来源于针叶树种无关。（3）为了研究TcLBD6过表达在代谢物层面上引起的变化,鉴于叶片的表型差异最明显,对TcLBD6-oe及WT-84K的叶片进行了代谢组分析,结果显示:TcLBD6过表达引起了多种代谢物的上调或下调,其中L-多巴、甲基多巴、异鼠李素、樱花素、木犀草素、秦皮素、矢车菊素和芍药素等多种有药用价值的代谢物显著上调,暗示了其在提高药用植物药物产量上的潜在利用价值。测得的所有差异代谢物中,L-多巴的上调倍数最大,且有抑制杂草生长的生物学功能;黄酮及其衍生物类物质上调或下调的种类最多,其中花青素类物质只表现为上调。这些结果说明,TcLBD6过表达能显著提高叶片中多种有药用价值的次生代谢物的含量。（4）为了验证代谢组的测定结果,提取了TcLBD6-oe及WT-84K叶片的L-多巴进行定性与定量分析,结果表明TcLBD6-oe叶片L-多巴含量显著高于WT-84K,进一步说明TcLBD6过表达对叶片L-多巴生物合成有促进作用;为了验证L-多巴对木本植物的生物学效应,用2m M的L-多巴水溶液对84K杨组培苗进行处理,结果表明与蒸馏水处理相比,L-多巴处理能够明显抑制84K杨的生长发育。（5）为了探讨TcLBD6促进84K杨L-多巴和花青素合成的机制,对TcLBD6-oe及WT-84K叶片进行了转录组分析,共检测到10 329个差异表达的基因,其中6 771个上调表达,3 558个下调表达。差异基因KEGG代谢通路分析显示:L-多巴生物合成通路中多个基因上调表达,其中多酚氧化酶（PPO）编码基因上调表达6.85倍,花青素合成通路中的基因普遍上调表达。JASPAR软件预测也显示84K杨多酚氧化酶（PPO）编码基因以及花青素合成通路中的查尔酮合成酶（CHS）和黄烷酮3-羟化酶（F3H）编码基因的启动子区域存在多个LBD转录因子结合位点,这为进一步研究TcLBD6与靶基因的互作奠定了基础。（6）为了探讨L-多巴抑制叶片发育的原因,本文聚焦非蛋白质氨基酸L-多巴的替换研究,采用Lable-free的方法对TcLBD6-oe及WT-84K叶片进行了蛋白质组分析,共鉴定到2 473个蛋白,其中差异表达的蛋白有130个,包括上调77个,下调53个。TcLBD6-oe与WT-84K植株蛋白质的氨基酸残基替换检索发现,TcLBD6-oe植株中多个蛋白出现特异位点L-多巴残基的替换。其中,内几丁质酶populus＿84k053195.T1第60位酪氨酸残基被L-多巴残基替换,第82位苯丙氨酸残基被L-多巴残基替换,表明TcLBD6过表达后可以引起转基因植株中一些蛋白质的酪氨酸残基或苯丙氨酸残基被L-多巴残基所替换,这是一个全新的发现。这些结果为研究TcLBD6通过L-多巴抑制叶片发育的作用机理提供了一个新的思路,值得今后进一步深入研究。（7）鉴于代谢组分析显示花青素在TcLBD6过表达的84K杨植株中显著上调,本文又初步分析了红豆杉中TcLBD6与其花青素生物合成基因之间的关系。通过序列搜索、多序列比对、保守结构域及系统发育关系分析,在红豆杉中鉴定了包括Tc CHS、Tc CH1-Tc HI2、Tc F3H1-Tc F3H5、Tc F3’H1-Tc F3’H4、Tc F3’5’H、Tc DFR1-Tc DFR8、Tc ANS、Tc ANR和TcLAR1-TcLAR2在内的25个花青素生物合成相关酶的基因,并分析了这些基因的组织表达特异性。JASPAR软件预测显示,Tc CHI1、Tc F3H3、Tc F3’H4及Tc ANS基因启动子区域存在LBD转录因子的结合位点,这些结果为今后深入研究红豆杉中TcLBD6与其花青素生物合成基因之间的调控关系奠定了理论基础。