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研究背景和目的人脐带血间充质干细胞(human umbilical cord bloodmesenchymal stem cells,hUCB-MSCs)具有其他组织来源的间充质干细胞的生物学特性。目前的研究表明hUCB-MSCs含量较少,培养体系众多,但培养效率较低。对UCB-MSCs体外向成肌细胞分化的研究不够深入。因此,我们选择hUCB-MSCs作为研究的种子细胞,优化体外培养条件,探讨其体外诱导成肌细胞的能力,为肌源性疾病的治疗提供理想的种子细胞。实验方法①hUCB-MNCs培养体系的建立:应用淋巴细胞分离液法、羟乙基淀粉沉降法和羟乙基淀粉+淋巴细胞分离液两步法三不同方法分别从脐带血中获得单个核细胞(mononuclear cells,MNCs),应用L-DMEM、DMEM/F12和MesencultTM不同培养基,在不同胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)浓度和细胞接种密度下,培养UCB-MNCs。比较所获得的MNCs数量、原代培养时间和不同培养条件下hUCB-MSCs的生长情况。流式细胞仪对P3细胞进行细胞表面标记鉴定,并诱导成骨,观察其生物学特征。②基于上一部分的UCB-MSCs培养体系,建立以5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-Aza)为诱导剂的诱导成肌分化体系:MTT法选择5-Aza适宜的诱导浓度,对P3 hUCB-MNCs进行体外向成肌细胞诱导分化,于诱导后第7d和第14d进行MyoD1、myogenin和myosin heavy chain免疫荧光染色和Real-time PCR检测。实验结果建立了hUCB-MSCs稳定有效的培养体系:应用羟乙基淀粉+淋巴细胞分离液两步法采集单个核细胞的数量较多(P＜0.01);10%FBS DMEM/F12和MesencultTM培养基,T25培养瓶中细胞接种密度为5×10~7时培养效率高于各对照组(P＜0.01);贴壁细胞表达CD29、CD105,不表达CD34、CD45、CD90、CD133;经成骨诱导培养21d后,细胞Yon Kossa染色可见矿化结节。P3 UCB-MNCs经5μmmol/L5-Aza诱导7d后,免疫荧光检测仅表达MyoD1;当诱导后14d时,可见MyoD1和myogenin阳性表达。始终无myosin heavy chain的表达。Real-time PCR检测显示诱导后14d较7d,MyoD1和myogenin的相对浓度增高,而无myosin heavy chain的表达。另外,在未诱导条件下UCB-MNCs同样能表达MyoD1。实验结论脐带血中存在一定数量的间充质干细胞,通过改善hUCB-MSCs分离方法,优化培养条件,提高了培养效率。UCB-MSCs不表达造血干细胞和内皮细胞表面标记,表达与骨髓间充质干细胞表面标记,并能够诱导成骨,符合间充质干细胞的特点。在成肌细胞分化中,hUCB-MSCs经5μmmol/L5-Aza诱导后,表达成肌细胞分化过程中的调节因子,能够向成肌细胞分化,而且在未诱导条件下能够保持成肌细胞分化的潜能。