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研究方法与结果
目的
通过观察大鼠骨癌痛(Cancer-induced bone pain, CIBP)模型脊髓水平γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid,GABA)、GABA合成酶及GABA转运体的表达变化和鞘内注射GABA及GAT-1抑制剂NO-711后CIBP大鼠的疼痛行为学变化情况来探讨神经元-胶质细胞介导的GABA信号通路对骨癌痛的调控作用。
方法
1.大鼠骨癌痛模型的构建
选取雌性SD大鼠(180-200 g)30只，随机分为三组(n=10)：空白对照组(Na?ve组)，假手术组(Sham组)，骨癌痛组(CIBP组)。Na?ve组不作任何处理，Sham组于右侧胫骨骨髓腔内注射10μl磷酸盐缓冲溶液(Phosphate buffered saline, PBS)，CIBP组于右侧胫骨骨髓腔内注射等体积的Walker256乳腺癌细胞悬液。采用电子测痛仪分别测量各组大鼠的机械缩足阈值(Paw withdrawal threshold, PWT)，将大鼠的疼痛行为学变化情况作为成功构建骨癌痛模型的标准。
2.检测CIBP模型大鼠脊髓水平GABA通路中各分子的表达变化及星型胶质细胞的激活情况
选取雌性SD大鼠(180-200 g)50只，随机分为五组(n=10)：空白对照组(Na?ve组)，假手术组(Sham组)，造模后7d组(CIBPD7组)，造模后14d组(CIBPD14组)及造模后21d(CIBPD21组)。采用westernblot检测各组大鼠脊髓水平谷氨酸脱羧酶(Glutamic acid decarboxylase, GAD)65、GAD67及GABA转运体-1(γ-aminobutyricacidtransporter-1,GAT-1)的表达变化和星型胶质细胞的激活情况(n=6)。此外，采用免疫荧光技术观察上述各组大鼠脊髓水平GABA的表达改变和GAD65、GAD67及GAT-1的细胞定位情况(n=4)。
3.观察鞘内注射GABA后CIBP大鼠的疼痛行为学变化情况
选取雌性SD大鼠(180-200g)24只，随机分为四组(n=6)：空白对照组(Na?ve组)，CIBP+NS组(V组)，CIBP+0.5μgGABA组，CIBP+1.0μgGABA组。GABA组大鼠鞘内注射不同剂量的GABA(0.5μg/10μl，1.0μg/10μl)，V组大鼠鞘内注射等体积的生理盐水。于14d鞘内注射不同浓度的GABA检测单次鞘内注射GABA对CIBP组大鼠双侧后足PWT的影响。于14-18d(连续5d,每天1次)鞘内注射GABA(1.0μg/10μl)检测连续鞘内注射GABA对CIBP组大鼠造模同侧后足PWT的影响。
4.观察鞘内注射GAT-1抑制剂NO-711后CIBP大鼠的疼痛行为学变化情况
选取雌性SD大鼠(180-200 g)16只，随机分为四组(n=4)：CIBP+NS组(V组)，CIBP+10μgNO-711组，CIBP+50μgNO-711组，CIBP+100μgNO-711组。NO-711组大鼠鞘内注射不同剂量的NO-711(10μg/10μl，50μg/10μl，100μg/10μl)，V组大鼠鞘内注射等体积的生理盐水。于14d鞘内注射不同浓度的NO-711检测单次鞘内注射NO-711对CIBP组大鼠双侧后足PWT的影响。于14-18d(连续5d,每天1次)鞘内注射NO-711(100μg/10μl)，检测连续鞘内注射NO-711对CIBP组大鼠造模同侧后足PWT的影响。采用westernblot和免疫荧光组织化学检测各组大鼠脊髓腰膨大组织GAT-1和胶质纤维酸性蛋白(Glia fibrillary acidic protein，GFAP)的表达变化情况。
结果
1.大鼠CIBP模型的构建
大鼠胫骨骨髓腔内注射Walker256乳腺癌细胞可以诱发大鼠疼痛行为学变化，可以成功构建大鼠CIBP模型。与Na?ve组和Sham组相比，造模成功的CIBP组大鼠PWT从造模后第5d开始显著下降，一直持续到21d(p<0.001)。
2.检测CIBP模型大鼠脊髓水平GABA通路中各分子的表达变化及星型胶质细胞的激活情况
免疫荧光结果显示CIBP组大鼠脊髓水平GABA的荧光强度较Na?ve组及Sham组下降。Westernblot和免疫荧光结果显示与Na?ve组和Sham组相比，CIBP组大鼠脊髓水平GAD65的表达于造模后21d上调(p<0.001)，GAD67的表达在各组之间未见明显差异(p>0.05)。GAT-1和GFAP于造模后14d及21d的表达均显著上调(p<0.05，p<0.01，p<0.001)，且二者的变化趋势基本一致。此外，免疫荧光结果显示GAT-1大部分和星型胶质细胞(GFAP)共表达，少部分和神经元(NeuN)共表达。
3.观察鞘内注射GABA后CIBP大鼠的疼痛行为学变化情况
于14d单次鞘内注射GABA(0.5μg/10μl，1.0μg/10μl)可显著提高CIBP组大鼠双侧后足的PWT，并于给药后15min起效，1h达峰，2h药效开始消退。此外，连续5d鞘内注射GABA(1.0μg/10μl)可以显著提高CIBP组大鼠的PWT，且不出现耐受情况。
4.观察鞘内注射GAT-1抑制剂NO-711后CIBP大鼠的疼痛行为学变化情况
于14d单次鞘内注射NO-711(10μg/10μl)对CIBP组大鼠的PWT无影响。而单次鞘内注射NO-711(50μg/10μl，100μg/10μl)可显著提高CIBP组大鼠造模同侧后足的PWT，于给药后15min起效，30min药效达峰，3h药效消退。此外，连续5d鞘内注射NO-711(100μg/10μl)可以显著升高CIBP组大鼠造模同侧后足的PWT，且不出现耐受情况。Westernblot和免疫荧光组织化学检测显示较V组，CIBP+100μgNO-711组大鼠脊髓水平GAT-1及GFAP的表达显著下降(p<0.05，p<0.01)。
结论
1.CIBP组大鼠脊髓水平GAT-1表达上调，且GAT-1主要位于星型胶质细胞上。表达增加的GAT-1可以引起突触间隙GABA的转运增加，从而减弱GABA的抑制作用。
2.CIBP组大鼠脊髓水平GABA的表达下降。同时，鞘内注射GABA可以缓解CIBP大鼠的疼痛行为学。
3.鞘内注射NO-711可以通过下调CIBP大鼠脊髓水平GAT-1和GFAP的表达来缓解CIBP大鼠的疼痛行为学。
目的
通过观察大鼠骨癌痛(Cancer-induced bone pain, CIBP)模型脊髓水平γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid,GABA)、GABA合成酶及GABA转运体的表达变化和鞘内注射GABA及GAT-1抑制剂NO-711后CIBP大鼠的疼痛行为学变化情况来探讨神经元-胶质细胞介导的GABA信号通路对骨癌痛的调控作用。
方法
1.大鼠骨癌痛模型的构建
选取雌性SD大鼠(180-200 g)30只，随机分为三组(n=10)：空白对照组(Na?ve组)，假手术组(Sham组)，骨癌痛组(CIBP组)。Na?ve组不作任何处理，Sham组于右侧胫骨骨髓腔内注射10μl磷酸盐缓冲溶液(Phosphate buffered saline, PBS)，CIBP组于右侧胫骨骨髓腔内注射等体积的Walker256乳腺癌细胞悬液。采用电子测痛仪分别测量各组大鼠的机械缩足阈值(Paw withdrawal threshold, PWT)，将大鼠的疼痛行为学变化情况作为成功构建骨癌痛模型的标准。
2.检测CIBP模型大鼠脊髓水平GABA通路中各分子的表达变化及星型胶质细胞的激活情况
选取雌性SD大鼠(180-200 g)50只，随机分为五组(n=10)：空白对照组(Na?ve组)，假手术组(Sham组)，造模后7d组(CIBPD7组)，造模后14d组(CIBPD14组)及造模后21d(CIBPD21组)。采用westernblot检测各组大鼠脊髓水平谷氨酸脱羧酶(Glutamic acid decarboxylase, GAD)65、GAD67及GABA转运体-1(γ-aminobutyricacidtransporter-1,GAT-1)的表达变化和星型胶质细胞的激活情况(n=6)。此外，采用免疫荧光技术观察上述各组大鼠脊髓水平GABA的表达改变和GAD65、GAD67及GAT-1的细胞定位情况(n=4)。
3.观察鞘内注射GABA后CIBP大鼠的疼痛行为学变化情况
选取雌性SD大鼠(180-200g)24只，随机分为四组(n=6)：空白对照组(Na?ve组)，CIBP+NS组(V组)，CIBP+0.5μgGABA组，CIBP+1.0μgGABA组。GABA组大鼠鞘内注射不同剂量的GABA(0.5μg/10μl，1.0μg/10μl)，V组大鼠鞘内注射等体积的生理盐水。于14d鞘内注射不同浓度的GABA检测单次鞘内注射GABA对CIBP组大鼠双侧后足PWT的影响。于14-18d(连续5d,每天1次)鞘内注射GABA(1.0μg/10μl)检测连续鞘内注射GABA对CIBP组大鼠造模同侧后足PWT的影响。
4.观察鞘内注射GAT-1抑制剂NO-711后CIBP大鼠的疼痛行为学变化情况
选取雌性SD大鼠(180-200 g)16只，随机分为四组(n=4)：CIBP+NS组(V组)，CIBP+10μgNO-711组，CIBP+50μgNO-711组，CIBP+100μgNO-711组。NO-711组大鼠鞘内注射不同剂量的NO-711(10μg/10μl，50μg/10μl，100μg/10μl)，V组大鼠鞘内注射等体积的生理盐水。于14d鞘内注射不同浓度的NO-711检测单次鞘内注射NO-711对CIBP组大鼠双侧后足PWT的影响。于14-18d(连续5d,每天1次)鞘内注射NO-711(100μg/10μl)，检测连续鞘内注射NO-711对CIBP组大鼠造模同侧后足PWT的影响。采用westernblot和免疫荧光组织化学检测各组大鼠脊髓腰膨大组织GAT-1和胶质纤维酸性蛋白(Glia fibrillary acidic protein，GFAP)的表达变化情况。
结果
1.大鼠CIBP模型的构建
大鼠胫骨骨髓腔内注射Walker256乳腺癌细胞可以诱发大鼠疼痛行为学变化，可以成功构建大鼠CIBP模型。与Na?ve组和Sham组相比，造模成功的CIBP组大鼠PWT从造模后第5d开始显著下降，一直持续到21d(p<0.001)。
2.检测CIBP模型大鼠脊髓水平GABA通路中各分子的表达变化及星型胶质细胞的激活情况
免疫荧光结果显示CIBP组大鼠脊髓水平GABA的荧光强度较Na?ve组及Sham组下降。Westernblot和免疫荧光结果显示与Na?ve组和Sham组相比，CIBP组大鼠脊髓水平GAD65的表达于造模后21d上调(p<0.001)，GAD67的表达在各组之间未见明显差异(p>0.05)。GAT-1和GFAP于造模后14d及21d的表达均显著上调(p<0.05，p<0.01，p<0.001)，且二者的变化趋势基本一致。此外，免疫荧光结果显示GAT-1大部分和星型胶质细胞(GFAP)共表达，少部分和神经元(NeuN)共表达。
3.观察鞘内注射GABA后CIBP大鼠的疼痛行为学变化情况
于14d单次鞘内注射GABA(0.5μg/10μl，1.0μg/10μl)可显著提高CIBP组大鼠双侧后足的PWT，并于给药后15min起效，1h达峰，2h药效开始消退。此外，连续5d鞘内注射GABA(1.0μg/10μl)可以显著提高CIBP组大鼠的PWT，且不出现耐受情况。
4.观察鞘内注射GAT-1抑制剂NO-711后CIBP大鼠的疼痛行为学变化情况
于14d单次鞘内注射NO-711(10μg/10μl)对CIBP组大鼠的PWT无影响。而单次鞘内注射NO-711(50μg/10μl，100μg/10μl)可显著提高CIBP组大鼠造模同侧后足的PWT，于给药后15min起效，30min药效达峰，3h药效消退。此外，连续5d鞘内注射NO-711(100μg/10μl)可以显著升高CIBP组大鼠造模同侧后足的PWT，且不出现耐受情况。Westernblot和免疫荧光组织化学检测显示较V组，CIBP+100μgNO-711组大鼠脊髓水平GAT-1及GFAP的表达显著下降(p<0.05，p<0.01)。
结论
1.CIBP组大鼠脊髓水平GAT-1表达上调，且GAT-1主要位于星型胶质细胞上。表达增加的GAT-1可以引起突触间隙GABA的转运增加，从而减弱GABA的抑制作用。
2.CIBP组大鼠脊髓水平GABA的表达下降。同时，鞘内注射GABA可以缓解CIBP大鼠的疼痛行为学。
3.鞘内注射NO-711可以通过下调CIBP大鼠脊髓水平GAT-1和GFAP的表达来缓解CIBP大鼠的疼痛行为学。