本实验室前期研究鉴定筛选出绿色木霉菌具有明显的抗黄曲霉功能:其发酵液对黄曲霉菌丝生长和孢子萌发具有显著抑制作用，且能抑制毒素的产生并降解黄曲霉毒素B1。并初步鉴定筛选出三个抗性相关蛋白。本研究采用分子克隆、原核表达、基因表达和体外抑菌等方法对其中两个抗菌相关蛋白进行研究，结果表明:　　 1、绿色木霉TvRBL基因的分子特征和抗黄曲霉功能分析　　 (1)基于抗菌蛋白质的de-novo质谱测定，得到的部分肽段序列，采用同源克隆得到TvRBL基因含444bp的开放读码框，编码147个氨基酸的，通过生物信息学分析，分子量为16 kDa，等电点为8.89。预测TvRBL蛋白为蓖麻毒蛋白超家族，具有(Q-X-W)3和糖基结合位点。TvRBL基因编码的蛋白含有7个磷酸化位点，其中包括4个丝氨酸磷酸化位点(15、47、87、99)，3个络氨酸磷酸化位点(8、103、109)。TvRBL基因推导氨基酸序列含有Ricin B-type lectin6-143活性位点。克隆得到TvRBL基因组序列为444 bp，无内含子。　　 (2)构建了pET30a-TvRBL原核表达载体，获得大小约20 kD蛋白条带，通过镍柱亲和层析后，获得纯化的20 kD的TvRBL蛋白。体外实验表明TvRBL纯化蛋白不能抑制黄曲霉菌丝生长。　　 (3)体外实验表明TvRBL未纯化蛋白具有能够延缓黄曲霉孢子萌发和菌丝生长速度的功能，但不能最终抑制黄曲霉菌丝生长。　　 (4) Real-time RT-PCR结果分析表明，TvRBL未纯化蛋白抑制黄曲霉毒素合成途径中相关基因aflL、aflO的表达，而aflE、 aflH、aflK、aflM、aflP、aflR、aflS、aflV、aflW、aflX、aflY基因的表达有显著的先上调后下调的特征。　　 (5)构建了YTvRBL-GFP载体，亚细胞定位进行分析表明，TvRBL蛋白定位在细胞壁和细胞质中。　　 2、绿色木霉TvALP基因分子特征和原核表达　　 (1)基于抗菌蛋白质的de-novo质谱测定，得到的部分肽段序列，采用同源克隆得到TvALP基因的1230 bp的开放读码框，编码409个氨基酸，通过生物信息学分析，分子量为43 kDa，等电点为7.96。Signal P预测含有一段长为20个氨基酸的信号肽序列。预测TvALP蛋白为肽酶抑制因子(Peptidaseinhibitor_I9)超家族、丝氨酸蛋白酶S8家族的一个成员，具有两个钙离子结合位点，同时具有Ser-His-Asp催化三联体位点，丝氨酸活性位点(GTSMATPHVVG351-361)、组氨酸活性位点(HGTHVSGTIAG192-202)和天冬氨酸活性位点（AYVVDSGINTSH158-168）。　　 (2)构建了pET30a-TvALP原核表达载体和切除信号肽的pET30a-QCTvALP原核表达载体，切除信号肽后获得大小约45 kD的蛋白条带。经超声波破碎后发现蛋白主要聚集在沉淀，形成了包涵体。经纯化、变性、复性后，未能获得有活性的蛋白。　　 (3)通过5个中性氨基酸的柔性多肽序列将TvRBL基因融合到TvALP基因的下游，成功构建了pET30a-RhTvALP-linker-RhTvRBL原核表达载体以及切除信号肽的pET30a-QCRhTvALP-linker-RhTvRBL原核表达载体，切除信号肽后获得大小约60 kD的蛋白条带。　　 本研究分析了绿色木霉TvRBL的分子特征和抗黄曲霉功能，Real-timeRT-PCR结果表明TvRBL蛋白具有延缓黄曲霉孢子萌发和菌丝生长的功能，能够抑制黄曲霉毒素合成相关基因aflL、aflO的表达。这为防治黄曲霉提供了一种理论依据。通过添加柔性多肽序列成功构建了融合基因的表达载体，并在大肠杆菌中表达，为进一步研究融合基因在抗黄曲霉污染的分子机制奠定了基础。