紫色红曲霉M-32对凡纳滨对虾的益生作用研究

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红曲霉(Monascus spp.)是一类丝状真菌,在亚洲地区已有上千年用作红曲的发酵菌株的应用历史。红曲霉能产生多种包括红曲色素、抗菌物质、Monacolin K、麦角甾醇和多种消化酶在内的次级代谢物,并对哺乳动物和家禽表现出广泛的生物学功能。但是尚未有红曲霉作为水产动物益生菌的研究报道。本研究从福建红曲中分离鉴定一株紫色红曲霉M-32,通过基因组测序分析预测其功能基因,进而推断其益生功能。然后分别制备紫色红曲霉菌粉和发酵功能豆粕,并以不同比例添加到饲料中,研究其对凡纳滨对虾生长及健康的影响。主要研究结果如下:(1)从红曲样品中分离得到4株产红色色素的丝状真菌,其中菌株M-32菌丝中的麦角固醇和色素含量显著高于其他分离菌株,色价分别达到805.09μg/g和2684.98 U/g。经过ITS r DNA序列比对,该菌被鉴定为紫色红曲霉并保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(保藏号CGMCC No.19377)。利用基因组测序技术完成了紫色红曲霉M-32基因组草图。其基因组大小约为26 Mb,预测有8035个编码基因和144个t RNA基因。其氨基酸序列注释得到93个糖苷水解酶,51个糖基转移酶,45个辅助氧化酶和44个糖类酯解酶,表明该菌株有强大的碳水化合物代谢能力。紫色红曲霉M-32基因组中预测到19个负责次级代谢产物合成的基因簇,主要为Ⅰ型聚酮合酶(T1PKS)和非核糖体多肽合成酶(NRPS),还有少量的萜类(Terpene)合成基因簇及β-内脂类型的基因簇。这些基因簇可使得紫色红曲霉M-32具有抗菌、抗氧化的能力。(2)制备了紫色红曲霉M-32菌粉,用不同添加量(T0组:0 g/kg、T1组:5 g/kg、T2组:10 g/kg、T3组:20 g/kg)添加于基础饲料后分别饲喂凡纳滨对虾。结果显示:8周后,与对照组(T0)相比,T1、T2组的饲料系数(FCR)显著降低(P<0.05),T3组的成活率(SR)显著升高(P<0.05);实验组凡纳滨对虾肝胰腺的胰蛋白酶活性、脂肪酶和淀粉酶的活性没有显著变化(P>0.05);饲料中添加紫色红曲霉M-32菌粉能显著提高凡纳滨对虾肝胰腺的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH),降低丙二醛(MDA)的含量(P<0.05);饲喂紫色红曲霉M-32菌粉能显著提高凡纳滨对虾血液中碱性磷酸酶(AKP)和溶菌酶(LSZ)活性(P<0.05)并可显著改善包括绒毛高度、绒毛宽度和肌肉厚度在内的肠道形态结构;T1、T2和T3组的肠道菌群组成与对照组存在差异性显著,饲料中添加紫色红曲霉M-32菌粉能显著影响凡纳滨对虾肠道微生物组成,显著提升乳酸杆菌的相对丰度;添加紫色红曲霉M-32菌粉可增强对虾对副溶血性弧菌感染的抵抗力。(3)将紫色红曲霉M-32用于制备发酵功能豆粕。结果显示:豆粕经紫色红曲霉M-32发酵后,粗蛋白含量由46.03%提升至51.60%,酸溶蛋白含量由5.36%提升至到19.16%,大分子的蛋白质比例下降;发酵豆粕中麦角固醇的含量为149.15μg/g。用紫色红曲霉M-32发酵豆粕分别替代基础饲料中20%(S20)、40%(S40)和60%(S60)的豆粕后饲喂凡纳滨对虾42d。结果显示:3个红曲霉发酵豆粕组凡纳滨对虾的增重率(WGR)和特定生长率(SGR)都显著高于对照组(P<0.05),饲料系数(FCR)显著低于对照组(P<0.05),S60组凡纳滨对虾的成活率(SR)显著高于对照组(P<0.05);3个红曲霉发酵豆粕组凡纳滨对虾肝胰腺的丙二醛(MDA)含量都显著低于对照组(P<0.05),超氧化物歧化酶(SOD)活性显著高于对照组(P<0.05),S60组凡纳滨对虾血清中的溶菌酶(LZM)活性和肌肉中的磷含量显著高于对照组、S20和S40组(P<0.05);S40和S60组凡纳滨对虾肌肉中钙的含量比对照组和S20组显著增加(P<0.05);饲料添加红曲霉发酵豆粕能显著降低副溶血弧菌攻毒后凡纳滨对虾的累积死亡率(P<0.05)并显著改善肠道形态;饲料添加红曲霉发酵豆粕可以影响凡纳滨对虾肠道菌群组成,S60组的Sob、Chao和ACE指数均显著低于对照组(P<0.05),且放线菌门(Actinobacteria)和疣微菌门(Verrucomicrobia)的丰度明显增加,变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)减少;红曲发酵豆粕组Demequina属、弧菌属(Vibrio)、假鲁杰氏菌属(Pseudoruegeria)、Hoppeia属和Haloferula属增加,而鲁杰氏菌属(Ruegeria)、希瓦氏菌属(Shewanella)、海绵单胞菌属(Spongiimonas)、乳杆菌属(Lactobacillus)和红球菌属(Rhodococcus)明显减少;肠道代谢组学分析结果表明,和对照组相比,S60组上调的代谢物有54种,下调的有85种,白三烯C5(Leukotriene C5)、前列腺素A1(Prostaglandin A1,PGA1)含量显著提升,而牛磺鹅去氧胆酸(Taurochenodeoxycholic acid,TCDCA)、肌肽(Carnosine)和衣康酸(Itaconic acid)含量显著下降。(4)利用紫色红曲霉M-32发酵豆粕分别替代基础饲料中20%(F20)、40%(F40)和60%(F60)的鱼粉后饲喂凡纳滨对虾42d。结果显示:红曲霉发酵豆粕替代鱼粉的比例为20%和40%时,对虾的WGR、FCR、SGR和SR与对照组相比无显著差异(P>0.05)。替代比例为60%时,FCR显著升高(P<0.05);红曲霉发酵豆粕组凡纳滨对虾肝胰腺的MDA含量显著低于对照组(P<0.05),F60组凡纳滨对虾血清中的LZM和PO活性以及肌肉中钙的含量和血液中磷的含量都显著高于对照组(P<0.05);红曲霉发酵豆粕替代饲料中的鱼粉能显著降低副溶血弧菌攻毒后的累积死亡率(P<0.05);红曲霉发酵豆粕替代鱼粉可以影响肠道结构,替代比例为20%时,肠道形态结构有改善,替代比例为40%和60%时,肠道结构有损伤;红曲霉发酵豆粕替代鱼粉可以影响肠道菌群组成,红曲霉发酵豆粕组的Sob、Chao和ACE指数均显著低于对照组(P<0.05),在门的水平上表现为变形菌门和厚壁菌门的丰度减少、放线菌门和拟杆菌门(Bacteroidetes)的丰度明显增加。在属水平上表现为F60组中Demequina菌属、弧菌属、假鲁杰氏菌属(Pseudoruegeria)、沈氏菌属(Shimia)的丰度增加,而鲁杰氏菌属(Ruegeria)、希瓦氏菌属(Shewanella)、海绵单胞菌属(Spongiimonas)、乳杆菌属(Lactobacillus)和红球菌属(Rhodococcus)丰度下降;肠道代谢组学分析结果表明,F60组上调的代谢物有49种,下调的有140种,F60组的白三烯C5、前列腺素A1,和大豆苷元(Daidzein)含量显著高于对照组,而牛磺鹅去氧胆酸、肌肽(Carnosine)和衣康酸含量显著低于对照组。综上所述:本研究从红曲样品中分离得到1株麦角固醇和色素高产菌株紫色红曲霉M-32,基因组分析发现该菌株含有大量碳水化合物代谢酶基因和次级代谢产物基因簇,具备开发成水产益生菌的潜力;动物实验表明,基础饲料中添加紫色红曲霉M-32菌粉可以提高凡纳滨对虾的生长性能、促进肠道健康、改善肠道菌群、提高对虾的抗感染能力;利用紫色红曲霉M-32发酵豆粕可以提高豆粕的粗蛋白和酸溶蛋白含量,并增加麦角固醇和红曲色素等功能成分,利用红曲霉发酵豆粕替代基础饲料中的豆粕或鱼粉制备的功能饲料能够提高凡纳滨对虾的生长性能、改善肠道菌群和肠道代谢组。
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