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大多数叶绿体蛋白是由核基因编码,在胞质中以前体蛋白形式合成,通过叶绿体双层膜上的TOC、TIC复合体而被转入叶绿体。在叶绿体前体蛋白的N端存在一段大约20-150个氨基酸残基的短肽——转运肽,它是叶绿体前体蛋白输入叶绿体所必需的。在叶绿体前体蛋白输入叶绿体后,叶绿体基质中的蛋白水解酶会将转运肽从前体蛋白中切除,而后不含转运肽的叶绿体前体蛋白在叶绿体中折叠成熟以发挥功能。由于叶绿体膜上的TOC、TIC复合体孔径较小,很多学者因此认为该复合体无法转运成熟蛋白,进而推测叶绿体前体蛋白在胞质中应以未折叠的肽链存在。然而,体外实验表明,叶绿体是可以转运成熟蛋白进入叶绿体。在本研究中,我们提供了在植物体细胞中,叶绿体也能转运成熟蛋白的证据。以拟南芥为研究材料,我们通过构建Pro35S:Atg8a-RbcS-GFP转基因株系,获得了表达融合蛋白ATG8A-RBCS-GFP的植株。由于RBCS转运肽被隐藏在融合蛋白ATG8A-RBCS-GFP的内部,所以该融合蛋白并不会被转入叶绿体,而将在胞质中成熟。胞质成熟的ATG8A-RBCS-GFP蛋白会被ATG4B蛋白在ATG8A蛋白的C端切割,而产生胞质成熟的融合蛋白RBCS-GFP。观察发现,Pro35S:Atg8a-RbcS-GFP转基因株系的叶绿体呈现明亮的叶绿体荧光,表明成熟蛋白RBCS-GFP能被转入叶绿体。作为对照,转基因株系Pro35S:Atg8aGA-RbcS-GFP(ATG8A蛋白C端切割位点Gly突变为ALa,而导致切割无法正常进行)的叶绿体仅呈现微弱荧光。同时,转基因株系Pro35S:Atg8a-GFP和Pro35S:Atg8aGA-GFP的叶绿体并不呈现绿色荧光。Western Blot结果显示,ATG8A-RBCS-GFP融合蛋白的切割和预期结果一致,而ATG8AG/A-RBCS-GFP融合蛋白并不如预期结果一样不发生切割,而是仍有少量蛋白被切割,这解释了Pro35S:Atg8aG/A-RbcS-GFP转基因株系叶绿体仅呈现微弱荧光的现象。上述结果表明,在植物体细胞中,成熟蛋白也能被转入叶绿体。利用该系统,我们又研究了叶绿体转运肽RBCS上磷酸化位点的功能。有研究表明,很多转运肽上存在着能被磷酸化的Ser位点。我们发现,转基因株系Pro35S:RbcSAla-GFP-H2B和Pro35S:RbcSAsp-GFP-H2B的叶绿体及细胞核都呈现明亮的绿色荧光,不同于转基因株系Pro35S:RbcS-GFP-H2B(H2B为核定位蛋白)仅叶绿体有绿色荧光,表明Ser位点的突变会影响前体蛋白输入叶绿体的效率。同时,对转基因株系Pro35S:mcherry-Atg8s-RbcSNt-GFP-H2B进行观察,我们也仅发现叶绿体呈现明亮绿色荧光,而在Pro35S:mcherry-Atg8a-RbcSAla-GFP-H2B 和 Pro35S:mcherry-Atg8a-RbcSAsp-GFP-H2B转基因株系中,同样仅叶绿体呈现明亮绿色荧光,细胞核并不呈现绿色荧光。因为切割而来的 RBCSAla-GFP-H2B 和 RBCSAsp-GFP-H2B 蛋白包含成熟的 RBCSAla和 RBCSAsp转运肽,而Pro35S:RbcSAla-GFP-H2B和Pro35S:RbcSAsp-GFP-H2B转基因株系表达的RBCSAla和RBCSAsp并未形成成熟的转运肽。表明RBCS蛋白在胞质中的成熟与否,会影响RBCS蛋白被输入叶绿体的效率,进而揭示转运肽中Ser磷酸化位点参与转运肽的成熟。综上所述,我们的研究结果首次提供了在植物体细胞中,叶绿体仍能转运胞质成熟蛋白的证据,转运肽上Ser磷酸化位点参与转运肽的成熟。这些结果为进一步研究叶绿体蛋白输入叶绿体的机制提供了重要导向。