孤独症谱系障碍（Autism Spectrum Disorders,ASD）是一种神经发育障碍性疾病。近年来,ASD在全球发病率持续上升,但缺乏有效的治疗手段,给家庭和社会造成了沉重的负担。目前对ASD的研究日益增多,其具体发病机制尚不十分明确。有研究认为表观遗传机制和免疫功能异常与ASD的发病相关。DNA甲基化是一种主要的表观遗传方式,可通过影响基因结构的稳定性和基因表达参与疾病过程。目前认为DNA甲基化参与了ASD的发生发展过程,差异甲基化基因可能通过异常的基因表达而影响重要的生物过程和信号通路,从而促进ASD发病。因此,从表观遗传学角度研究ASD的差异甲基化基因并进行功能富集分析,有助于从遗传学层面更好地认识ASD发病机制。异常的免疫功能和炎症反应与ASD的发病相关,淋巴细胞亚群、免疫球蛋白及补体、细胞因子等是反应机体免疫功能的重要指标,共同维持机体免疫和炎症过程的平衡,一旦这种平衡被打破,将引起神经系统病理过程。分析ASD免疫指标的变化,将为研究ASD发病机制并寻求新的临床免疫检测指标提供新思路。本研究分为三部分,第一部分对基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）中ASD甲基化芯片数据进行综合分析,探索与ASD发病相关的差异甲基化基因并进行基因本体（Gene Ontology,GO）富集分析及京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路富集分析,探讨差异甲基化基因富集的通路是否与免疫和炎症过程有关,从表观遗传层面研究ASD发病机制;第二部分对ASD相关的差异甲基化基因m RNA表达进行研究,并建立核心差异甲基化基因的蛋白相互作用（Protein-Protein Interaction,PPI）网络,探讨差异甲基化基因的异常表达是否与免疫和炎症过程有关;第三部分对ASD患者免疫功能相关指标进行分析,了解ASD患儿全身免疫状态及炎症因子水平,将临床表型与表观遗传相结合,为研究ASD发病机制与干预手段提供新思路。第一部分孤独症谱系障碍DNA甲基化研究目的:研究与ASD发病相关的差异甲基化基因及其参与的信号通路,探讨ASD发病机制,为ASD的病因研究、早期发现提供依据。方法:首先从GEO数据库中下载甲基化芯片数据GSE131706（对照组17例、病例组17例）和GSE80017（对照组9例、病例组9例）,均为脑组织样本。应用Rn Beads 2.0软件对DNA甲基化数据进行整合分析,对病例组和对照组差异甲基化位点进行分析（|Δβ|＞0.1,P＜0.05）;应用David6.8在线软件对差异甲基化位点对应的差异甲基化基因进行GO富集分析和KEGG通路富集分析。下载甲基化芯片数据GSE109905（对照组31例、病例组38例,外周血样本）,对差异甲基化基因进行甲基化状态验证并使用R语言p ROC包进行ROC分析。下载甲基化芯片数据GSE53162和GSE53924（脑组织样本）,对部分差异甲基化基因的表达进行验证并进行ROC分析,研究差异甲基化基因是否具有诊断价值。结果:1.ASD中存在136个差异甲基化位点,包括高甲基化位点64个,低甲基化位点72个,差异甲基化位点主要集中在Cp G区域的open sea区和基因组的intergenic区。2.根据450K官方注释,得到差异甲基化位点对应的74个差异甲基化基因,包括38个高甲基化基因,36个低甲基化基因;GO和KEGG富集结果显示,差异甲基化基因功能主要富集于抗原加工和呈递等生物过程和通路,涉及的主要差异甲基化基因中,HLA-DRB1、HLA-DRB5、HLA-DQA1等参与抗原加工和呈递、细胞粘附分子、EB病毒感染、干扰素-γ介导的信号通路和MHC II类分子受体活性。3.经GSE109905数据集验证,结果显示15个差异甲基化基因的甲基化状态与整合分析一致,分别为FMN2、ACTR3、BAZ2B、ABI3BP、HTR4、DUSP22、RNF39、HLA-DRB5、HLA-DQA1、TSPAN18、NTM、DGKH、IL-16、CALCOCO2、COL5A3,ROC曲线分析显示FMN2、BAZ2B和HLA-DRB5（AUC值均大于0.6）对ASD具有潜在的诊断价值。GSE53162数据集、GSE53924数据集的验证结果表明,ASD患者ABI3BP、NTM和HLA-DRB5表达上调,HLA-DQA1表达下调,CALCOCO2、DUSP22、BAZ2B和HLA-DRB5（AUC值均大于0.6）对ASD具有潜在的诊断价值。小结:1.ASD患者存在DNA甲基化异常,部分差异甲基化基因对ASD具有潜在的诊断价值,提示DNA甲基化参与了ASD的发生。2.ASD差异甲基化基因功能主要富集于抗原加工和呈递等过程,涉及的主要差异甲基化基因为HLA,这些生物过程和基因主要参与机体免疫功能和过程,提示免疫过程可能在ASD的发病中发挥了重要作用。第二部分孤独症谱系障碍差异甲基化基因的m RNA表达研究目的:进一步确定与ASD密切相关的差异甲基化基因,分析目的基因在m RNA水平的表达,并建立差异甲基化基因的PPI网络,探讨ASD发病机制。方法:结合第一部分研究结果,进行Pubmed在线文献检索,查找与ASD或精神障碍性疾病发病密切相关的基因作为目的基因。纳入2020年1月至6月在河北省儿童医院确诊为ASD的患儿11例,同期在医院健康体检的正常对照组儿童7例,两组在性别、年龄等方面相匹配。应用RT-PCR方法对ASD组和正常对照组全血目的基因m RNA表达水平进行检测,应用SPSS软件分析比较两组目的基因的表达差异。以目的基因m RNA表达量为检验变量,ASD为状态变量,绘制各项指标预测ASD发生的ROC曲线,分析其诊断效能。对15个差异甲基化基因,使用在线String数据库建立PPI网络,再将结果输入Cytoscape软件,使用Cyto Hubba插件筛选核心差异甲基化基因。结果:1.与ASD密切相关的十个差异甲基化基因分别为FMN2、ACTR3、BAZ2B、HLA-DRB1、HLA-DRB5、HLA-DQA1、NTM、IL-16、CALCOCO2、COL5A3。2.与对照组相比,ASD组FMN2、BAZ2B、HLA-DRB1、NTM、IL-16、CALCOCO2表达明显上调,差异有统计学意义（P＜0.05）,HLA-DRB5、HLA-DQA1、ACTR3、COL5A3表达上调,但差异无统计学意义（P＞0.05）。FMN2、BAZ2B、NTM、IL-16预测ASD的AUC值分别为0.896、0.831、0.948、0.831（P＜0.05）,具有潜在的诊断价值。3.PPI分析发现三组相互作用较强的蛋白,HLA-DRB5和HLA-DQA1之间相互作用最强,其次是FMN2和ACTR3、CALCOCO2和BAZ2B之间的相互作用。小结:1.DNA甲基化异常导致了基因在m RNA水平的异常表达,提示差异甲基化基因可能通过影响相关基因表达参与ASD的发病过程。2.差异甲基化基因均可直接或间接参与免疫和炎症反应,提示异常表达的甲基化基因可能通过调节免疫和炎症过程共同促进ASD的发生发展。第三部分孤独症谱系障碍免疫功能的相关研究目的:分析ASD患儿外周血免疫功能相关指标变化,并与正常对照组儿童进行对比,为探索ASD发病机制与干预手段提供新思路。方法:纳入2019年1月至2020年12月在河北省儿童医院确诊为ASD的患儿165例,同期在医院健康体检的正常对照组儿童86例,两组在性别、年龄等方面相匹配。研究对象于入院后采集血标本进行免疫功能相关指标的检测,包括淋巴细胞亚群检测（CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD19+、CD56+、双阴性T细胞、双阳性T细胞）、免疫球蛋白和补体检测（Ig A、Ig G、Ig M、Ig E、补体C3、补体C4）、细胞因子检测（IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α）等。分析比较ASD组和对照组两组间各指标的差异,并对ASD患儿食物特异性Ig G抗体检测结果进行分析,了解ASD免疫状态。将ASD组根据CARS评分分为重度组和轻-中度组,分析比较重度组、轻-中度组、对照组三组间免疫功能相关指标的差异。以免疫功能相关指标为检验变量,ASD为状态变量,绘制各项指标单独及联合预测ASD发生的ROC曲线,分析其诊断效能。结果:1.与正常对照组相比,ASD组CD3+、CD4+、CD8+、CD56+、Ig A、Ig G、补体C3水平显著降低（P＜0.05）,CD19+、双阴性T细胞、Ig E、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α水平显著增高（P＜0.001）,CD4+/CD8+、双阳性T细胞、Ig M、补体C4水平无显著差异（P＞0.05）。2.与轻-中度ASD组相比,重度ASD组IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α水平显著增高（P＜0.05）,其它指标无显著差异（P＞0.05）。3.CD19+、双阴性T细胞、Ig E、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α单独预测ASD的AUC值分别为:0.840、0.654、0.766、0.761、0.799、0.848、0.899、0.877、0.765（P＜0.001）,淋巴细胞亚群、免疫球蛋白和补体、细胞因子各指标联合预测ASD的AUC值分别为0.910、0.917、0.917（P＜0.001）,具有潜在的诊断价值。4.ASD患者食物特异性Ig G抗体检出率为98.79%,以鸡蛋、牛奶、小麦为主。小结:1.ASD体内存在淋巴细胞亚群、免疫球蛋白、补体、细胞因子异常,可能是ASD患者免疫异常的基础,从而影响了免疫调节和炎症过程的平衡。2.部分异常的免疫学指标对ASD具有一定的诊断价值,提示免疫异常与ASD的发生相关。结论:1.ASD患者存在DNA甲基化异常,差异甲基化基因功能主要富集于抗原加工和呈递等过程,部分差异甲基化基因表达异常,对ASD具有潜在的诊断价值,提示差异甲基化基因可能通过影响基因表达和调控,进而影响抗原加工和呈递等免疫过程,参与ASD的发病。2.DNA甲基化异常导致了基因在m RNA水平的异常表达,核心差异甲基化基因可直接促进或参与免疫和炎症反应,提示异常表达的甲基化基因可通过调节免疫和炎症过程,促进ASD的病理过程。3.ASD体内存在淋巴细胞亚群、免疫球蛋白、补体、细胞因子异常,细胞因子与症状的严重程度有关,部分异常的免疫学指标对ASD具有潜在的诊断价值,提示免疫异常及炎症反应与ASD的发病相关。