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目的:亲和层析法分离纯化红桂木凝集素（Artocarpus lingnanensis lectin,ALL）,研究ALL对T淋巴细胞的增殖作用,并进一步检测经ALL刺激的CD4、CD8T淋巴细胞表达免疫检查点蛋白的水平,初步研究ALL是否会通过抑制免疫检查点相关通路促进T淋巴细胞增殖。方法:一、红桂木凝集素的分离纯化及其生物学活性分析。1.亲和层析分离纯化不同时间或不同产地红桂木凝集素。分别将广西6月、广西8月和海南6月产的红桂木种子研磨成粉末状,PBS抽提过滤,硫酸铵分级沉淀蛋白。沉淀蛋白经透析后上Gal-sepharose 6B亲和层析柱,PBS洗脱杂蛋白后换上含0.2Mol/L Gal的PBS缓冲液继续洗脱,收集洗脱峰液体,PBS透析至无Gal,将透析液冻成干粉状即为纯化的红桂木凝集素,放入-80℃备用。2.电泳检测ALL纯度及分子量将ALL冻干粉用适量PBS溶解,使用BCA测定三个产地ALL溶液的蛋白浓度,并计算三个产地ALL得率。利用SDS-PAGE和非变性PAGE分析ALL分子量和纯度。3.血凝试验验证ALL生物学活性采用U型血凝试验检测广西6月、广西8月、海南6月ALL血凝效价。二、ALL对T淋巴细胞增殖及活性的影响。1.CCK8及细胞计数检测ALL对T淋巴细胞增殖的影响。红细胞裂解液法分离健康体检者外周血淋巴细胞,用含有12.5ng/ml IL-2的RPMI1640细胞培养基中分别将淋巴细胞调整至1.0×10~6/ml,加入ALL与淋巴细胞共培养。CCK8和细胞形态学检测ALL对淋巴细胞增殖的影响。2.流式细胞技术检测ALL对CD3+T细胞表达的影响。将ALL与T淋巴细胞共培养,利用流式细胞技术检测ALL对CD3+T细胞表达的影响。3.流式细胞技术验证ALL对T淋巴细胞凋亡的影响。利用流式细胞仪测定ALL对淋巴细胞凋亡的影响,检测ALL对淋巴细胞的毒性作用。4.ELISA技术检测ALL刺激淋巴细胞释放细胞因子水平。利用ELISA技术,检测细胞培养上清中CD4T细胞与CD8T细胞释放细胞因子IL-2、GZMB的水平。三、ALL对CD4、CD8 T免疫检查点蛋白表达的影响。红细胞裂解液法从健康体检者血中分离出淋巴细胞,再经CD4、CD8免疫磁珠阳选技术筛选出CD4+T和CD8+T细胞,用12.5ng/ml IL-2的RPMI1640调整细胞至1.0×10~6/ml,将细胞种入六孔板中,分别加入不同浓度ALL培养24-96h,流式细胞术分别检测CD4+T及CD8+T细胞表面免疫检查点PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3蛋白表达量变化趋势。结果:一、ALL分离纯化及活性分析。1.电泳显示亲和层析方法获得纯化的ALL。SDS-PAGE电泳显示广西6月、广西8月、海南6月产的ALL电泳均显示两条带,分子量分别为10KDa和15KDa。非变性PAGE电泳显示一条带,无明显杂带,分子量约为60KDa,纯度合格。提示ALL是由两个亚基构成的四聚体。2.ALL具有较高的血凝活性。广西6月、广西8月和海南6月产地分离纯化的ALL得率分别为850ug/g、770ug/g、820ug/g。血凝试验显示,广西6月2mg/ml和1mg/ml ALL血凝活力为212,广西8月2mg/ml和1mg/ml ALL血凝活力为212,海南6月2mg/ml和1mg/ml ALL血凝活力分别为212和211。因此,我们认为,经亲和层析分离纯化的ALL具有较高的血凝活性。二、ALL对淋巴细胞有增殖及活化作用1.ALL刺激淋巴细胞集落式生长。形态学观察显示,经不同产地不同浓度ALL刺激后,淋巴细胞生长状况良好,ALL刺激组细胞呈集落式生长,出现大量增殖,其中25μg/ml ALL刺激淋巴细胞时效果较好。2.ALL刺激淋巴细胞增殖。在含有12.5ng/ml IL-2的细胞培养基中分别加入ALL刺激人淋巴细胞后,未刺激组与ALL刺激组相比较,ALL刺激组48h细胞数量开始增加,72h明显增加,96h持续增加。CCK8结果显示,在细胞培养基分别加入广西6月、广西8月和海南6月产的12.5μg/ml ALL后,淋巴细胞最大增殖率分别为80.13%±3.83、79.43%±1.04、76.3%±0.70;而在细胞培养基分别加入广西6月、广西8月和海南6月产的25μg/ml ALL后,淋巴细胞最大增殖率分别为99.03%±3.00、88.3%±4.68、94.03%±1.80。25μg/ml ALL较12.5μg/ml ALL对细胞刺激效果更佳,25μg/ml ALL刺激组与12.5μg/ml ALL刺激组两两比较,差异有统计学意义（P＜0.05）,其中广西6月和海南6月产的ALL较广西8月产的ALL效果更佳,差异有统计学意义（P＜0.05）。因此,我们后续将选用广西6月产的ALL进行后续实验。3.ALL促进CD3+T细胞表达。流式细胞技术检测CD3+T细胞表达显示,ALL从48h后开始呈现效应。24h、48h各组间无明显差异,72h、96h 12.5ug/ml ALL组与25ug/ml ALL组同对照组相比较,差异均有统计学意义（P＜0.005）。96h对照组、12.5μg/ml ALL组、25μg/ml ALL组表达量分别为45.93%±1.09、52.5%±0.88、51.96%±1.48。4.ALL对淋巴细胞无明显毒性流式细胞技术检测淋巴细胞凋亡结果显示,对照组、12.5μg/ml ALL组、25μg/ml ALL组凋亡率最低分别为15.82%±1.31、13.6%±3.07、13.96%±2.04;三组之间两两比较,差异没有统计学意义（P＞0.05）。ALL对淋巴细胞未显示明显毒性。5.ALL提高T淋巴细胞活性因子的释放ELISA分析显示,不论是CD4+T还是CD8+T亚群,ALL刺激组中细胞因子IL-2、GZMB释放量与对照组相比较均有明显增加。CD4+T细胞亚群中,对照组IL-2、GZMB的含量分别为120±0.57pg/m、9.66±2.51pg/ml;12.5μg/ml ALL组IL-2、GZMB的含量分别为471±7.2pg/ml、28.63±2.88pg/ml;25μg/ml ALL组IL-2、GZMB的含量分别为500±11.13pg/ml、40.86±3.44pg/ml。CD8+T细胞亚群中,对照组IL-2、GZMB的含量分别为8.11±0.45、9.20±2.55pg/ml;12.5μg/ml ALL组IL-2、GZMB的含量分别为459.66±7.50pg/ml、48.1±1.90pg/ml;25μg/ml ALL组IL-2、GZMB的含量分别为494.66±7.37pg/ml、49.13±2.15pg/ml。ALL组与对照组相比较,IL-2、GZMB分泌量差异有统计学意义（P＜0.001）。三、ALL对CD4+T和CD8+T细胞免疫检查点蛋白表达影响不明显1.ALL对CD4+T细胞免疫检查点蛋白表达无明显影响。流式细胞术显示ALL刺激CD4+T细胞24-96h后,对照组中PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3比例分别为18.2%±7.53、0.57%±0.43、33.13%±14.81、0.93%±0.15。12.5μg/ml ALL组中PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3比例分别为17.93%±7.41、0.50%±0.42、32.73%±14.1、1.04%±0.34。25μg/ml ALL组中PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3比例分别为17.33%±6.98、0.48%±0.38、32.46%±13.71、0.99%±0.31。ALL对CD4+T细胞免疫检查点蛋白表达量无明显差异。从结果可以看出,四种蛋白CD4+T细胞中表达量有明显差别,TIM-3和PD-1在T细胞中表达量较高,但ALL对CD4+T细胞中这4种免疫检查点蛋白的表达量影响不明显,差异无统计学意义（P＞0.05）。2.ALL对CD8+T细胞免疫检查点蛋白表达无明显影响。CD8+T细胞亚群中,流式细胞术显示ALL刺激CD8+T 24-96h后,对照组中PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3比例分别为8%±0.36、1.8%±0.18、70%±6.23、0.26%±0.13。12.5μg/ml ALL组中PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3比例分别为6.96%±0.41、1.64%±0.14、74.7%±12.56、0.25%±0.10。25μg/ml ALL组中PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3比例分别为6.91%±0.50、1.66%±0.12、75%±12.73、0.35%±0.075。通过进一步检测ALL在T细胞亚群中对PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3表达的影响,结果显示,CD8+T细胞亚群中,经ALL刺激组与对照组相比较,免疫检查点表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。提示在T细胞亚群中,ALL或许不通过抑制这4种免疫检查点蛋白的通路来促进T淋巴细胞增殖。结论:1.采用亲和层析可获得纯化的ALL,且具有较高的血凝活性。2.ALL对淋巴细胞具有活化和增殖作用。分离的三种ALL均可促进T细胞生长,且以广西6月和海南6月产的效果更佳。3.在含有12.5ng/ml IL-2的RPMI1640细胞培养基条件下,25μg/ml ALL较12.5μg/ml ALL对T淋巴细胞增殖作用更明显。4.流式细胞术检测凋亡结果显示12.5μg/ml ALL和25μg/ml ALL对淋巴细胞无明显毒性。5.经ALL活化的CD4+T和CD8+T细胞,其细胞因子IL-2、GZMB释放量增加,差异有统计学意义（P＜0.001）,表明经ALL活化的T细胞亚群具有更强的细胞因子分泌能力,能够更好地杀伤肿瘤细胞,从而发挥抗肿瘤作用。6.经ALL活化的CD4+T和CD8+T细胞中,免疫检查点表达量未受明显影响,提示在T细胞亚群中,ALL或许不通过抑制这4种免疫检查点蛋白的通路来促进T淋巴细胞增殖。