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鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)是2010年初在我国的江浙地区新发的一种黄病毒,引起蛋鸭的产蛋量急剧下降甚至停止,给我国的养殖业造成严重的经济损失。近些年对其分离鉴定、基因组特征和诊断方法的报道较多,但是对于该病毒中和表位和受体的研究成果较少,尤其是针对DTMUV蛋白受体的研究至今仍无进展。囊膜E蛋白作为DTMUV主要的结构蛋白,不仅可以刺激机体产生中和抗体,同时与受体结合介导病毒的入侵,对揭示病毒感染机制和免疫反应至关重要。本研究克隆并表达了DTMUV E蛋白,制备了多株单克隆抗体,筛选出一株具有中和活性的单克隆抗体,通过鉴定发现其中和表位位于E蛋白的Domain I区域,这是首次在黄病毒E蛋白Domain I区域发现的中和表位,丰富了我们对黄病毒中和表位的认识。通过对中和抗体的可变区进行克隆、序列分析和单链抗体(Sc Fv)的重组质粒构建,发现其轻链互补决定区序列具有显著的特异性,纯化的单链抗体具有一定的抗病毒效果,为针对该病的预防与治疗奠定了基础。采用免疫共沉淀和病毒-受体蛋白结合试验(VOPBA)技术对DTMUV的受体进行了初步筛选,但是未检测分离到与DTMUV易感细胞结合的蛋白受体,通过DTMUV E蛋白与血红细胞的血凝试验检测发现E蛋白具有一定的血凝活性,提示该病毒受体可能属于糖类,为该病的防控提供新的思路。具体研究内容如下:1.DTMUV E单克隆抗体的制备与鉴定本研究根据实验室分离的鸭坦布苏病毒WH2014株E基因序列(Gen Bank KY235382),构建了去信号肽成熟的E蛋白的重组质粒p ET-28a-E,采用原核诱导表达和纯化系统获得高纯度的E蛋白。将纯化后的E蛋白免疫BALB/c小鼠制备针对E蛋白的多株单克隆抗体,通过间接ELISA、间接免疫荧光和Western blot筛选获得2株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3B8G和3F12G。其腹水间接ELISA效价分别为1:51200和1:409600;亚类鉴定结果显示,Mc Ab 3B8G重链为Ig G1类,Mc Ab 3F12G重链为Ig G3类,轻链均为κ链;间接免疫荧光和Western blot结果显示,两株单抗均能与过表达的E蛋白具有特异性结合反应,并且与DTMUV同样产生特异性反应。病毒中和实验结果表明,Mc Ab 3B8G对DTMUV的中和效果较好。2.E蛋白中和抗原表位的鉴定通过生物信息学方法分析DTMUV E蛋白空间构象,对E蛋白的三个结构域进行截短突变体真核表达重组质粒的构建,间接ELISA、间接免疫荧光和Western blot检测发现Mc Ab 3B8G识别E蛋白的DEI区域,Mc Ab 3F12G识别E蛋白的Domain II区域。为了进一步鉴定效果较好的中和抗体3B8G在E蛋白DEI区域内的抗原表位最小功能区,本研究通过构建一系列覆盖E蛋白Domain I全长的截短突变体真核表达重组质粒,经IFA和Western blot检测,精确扫描定位了Mc Ab 3B8G识别的一个B细胞线性表位1FSCLGMQ7。3.抗DTMUV E蛋白单链抗体的制备与鉴定本研究在成功制备稳定分泌抗DTMUV E蛋白单抗杂交瘤细胞株的基础上,对两株单抗的VL区域扩增,比对分析其序列发现两株抗体在VL区域相似性较低,决定了抗体识别E蛋白结构域的特异性。通过基因工程方法,拼接抗DTMUV E蛋白单链抗体基因并构建了重组表达载体p ET 28a-DTMUV-E Sc Fv,表达纯化得到的单链抗体具有良好的抗病毒活性。4.DTMUV E蛋白受体的筛选为了研究DTMUV在易感细胞上的受体蛋白分子,本研究表达纯化了E蛋白和Domain III蛋白,通过间接免疫荧光法筛选与DTMUV易感细胞稳定结合的蛋白,发现E蛋白能够稳定结合DEF细胞、DF1细胞和Vero细胞。然后采用膜蛋白提取试剂盒提取以上三种细胞的膜蛋白,将膜蛋白、纯化的E蛋白和抗DTMUV的单抗进行免疫共沉淀和病毒-蛋白结合筛选,结果均未筛选到特异性可分离的DTMUV蛋白受体,血凝试验提示鸭坦布苏病毒的受体可能为糖类,为进一步研究病毒受体提供了思路。综上所述,本研究鉴定出DTMUV位于E蛋白Domain I结构域内的中和表位;分析了两株识别不同抗原区的单克隆抗体轻链可变区序列差异,构建了抗DTMUV E蛋白的单链抗体融合表达载体;对DTMUV的蛋白受体分子进行了初步筛选。本研究对建立鸭坦布苏病毒的防控与治疗技术具有重要意义。