【摘 要】
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目的:探究Kisspeptin-10（KP-10）对绵羊原代卵泡颗粒细胞（FGCs）类固醇激素合成以及细胞增殖和凋亡的影响及作用机制。方法:使用免疫荧光检测技术分离、培养并鉴定绵羊FGCs,在完全培养基中添加不同浓度KP-10,使用ELISA测定FGCs雌激素和孕酮的分泌,qPCR测定类固醇激素合成以及细胞增殖和凋亡的基因表达,CCK-8测定细胞活力,Western blot测定与细胞增殖和凋亡的
【基金项目】
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国家自然科学基金,项目编号:31460684； 甘肃省高校协同创新团队项目,项目编号:2017C-01；
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目的:探究Kisspeptin-10（KP-10）对绵羊原代卵泡颗粒细胞（FGCs）类固醇激素合成以及细胞增殖和凋亡的影响及作用机制。方法:使用免疫荧光检测技术分离、培养并鉴定绵羊FGCs,在完全培养基中添加不同浓度KP-10,使用ELISA测定FGCs雌激素和孕酮的分泌,qPCR测定类固醇激素合成以及细胞增殖和凋亡的基因表达,CCK-8测定细胞活力,Western blot测定与细胞增殖和凋亡的蛋白表达。主要结果表明:1、成功分离、培养绵羊原代FGCs,并用FSHR免疫荧光鉴定法进一步证实分离的细胞为FGCs;并证明了FGCs的细胞质上表达KISS-1基因;2、KP-10单独作用能够促进绵羊FGCs类固醇激素合成与分泌,且KP-10单独作用能够显著上调类固醇激素合成关键酶基因St AR、CYP11A1、3β-HSD以及KISS-1受体基因的表达;3、RNA-seq测序技术筛选和比较正常FGCs细胞组和浓度为100 nmol/L的KP-10处理的FGCs细胞组之间不同的差异基因,结果显示总共有202个差异显著基因,其中上调表达基因119个,下调表达基因83个,并筛选去6个与细胞增殖和周期相关的差异基因并使用qPCR技术进行验证,所得结果与RNA-seq测序结果基本相同。4、KP-10促进FGCs细胞增殖、抑制细胞凋亡,能够极显著上调Bcl-2、PI3K、AKT m RNA的表达（p＜0.01）;显著下调Bax、Caspase-3 m RNA的表达（p＜0.05）。100 nmol/L的KP-10处理FGCs能够极显著上调Bcl-2蛋白表达水平（p＜0.01）,并极显著下调Bax、AKT蛋白表达水平（p＜0.01）。综上表明,体外培养的绵羊FGCs的细胞质中表达KISS-1基因;KP-10能通过促进绵羊FGCs增殖、抑制细胞凋亡,或上调FGCs中类固醇激素合成关键酶的表达,显著促进绵羊FGCs中类固醇激素的合成分泌;在绵羊FGCs中KP-10可以通过PI3K/AKT信号通路调控FGCs细胞增殖、抑制细胞凋亡。
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