随着人口和人类需求的不断增长,人们对食品安全的关注度越来越高。食源性微生物作为食品安全的最大危害来源,时刻威胁着人类的健康。沙门氏菌作为最常见的食源性病原微生物,已经为大众所关注,然而目前的传统检测手段耗时且检测效率低下,已不能够满足人们对食品安全高要求的需要。所以,我们亟需研发出高效率且快速的检测手段,来监控沙门氏菌,保证人类的健康。环介导恒温核酸扩增法是在PCR基础上创建的一种理想的手段,该技术检测克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点,同时比传统的培养检测方法快捷方便,大大节省了工作人员的时间。此外,这种检测方法对检测人员的技术要求较低,实际操作很简便,不需要特殊的试剂和仪器设备,有利于建立成本低廉的快速筛选体系,因此绝对可以建立起总成本低廉的检测体系。该方法适用于现场检测和大量样品高通量检测,在临床疾病诊断,基因芯片开发及食品卫生质量检验等领域具有广阔的应用前景。原位恒温核酸扩增方法是在恒温核酸扩增方法的理论基础上完善的一种直接在完整的细胞内进行核酸扩增的新方法。它的反应特点是,不需要对细菌进行增殖,且能够进行可视化检测,还能对相同种类的不同生活周期细胞进行观察。该技术不需要对细胞或组织破碎以提取核酸,能够对细胞或组织中基因进行定位,同时还具有很高的灵敏度。此外,该技术技术只使用恒定且较低的反应温度,这样可以减少细胞的损坏,利于使用荧光标记抗体进行细胞鉴定,大量重复的目标基因能够防止细胞外泄漏基因的扩增影响结果,而且该技术中使用的低分子核酸聚合酶更容易进入细胞。本文以沙门氏菌作为研究对象,主要针对沙门氏菌的保守基因,设计特异性引物,建立了恒温核酸扩增体系实现了对沙门氏菌的特异性检测,同时,利用该特异性引物,结合针对沙门氏菌细胞通透性的研究,开发出沙门氏菌的原位恒温核酸扩增方法,并应用于检测人工污染的食品样本,以期为深入开发将恒温核酸扩增系列方法应用于食品安全检测领域提供理论研究基础和技术支持。主要研究内容和结果如下:(1)根据沙门氏菌属自身毒力基因的保守性,以inva基因为靶序列,设计沙门氏菌属特异性恒温核酸扩增引物,建立新型环介导恒温核酸扩增方法,实现对沙门氏菌的快速检测。结果表明:新型环介导恒温核酸扩增方法在65℃恒温条件下1h就完成对沙门氏菌的检测。检测过程发现,该扩增是非常特异性的,并不会对其他的革兰氏阴性菌的核酸进行扩增;且该方法具有很高的灵敏度,可达到10CFU/reaction,是PCR灵敏度的50倍;利用LAMP浊度仪能够实时的观测扩增的整个过程,并能够通过添加荧光染料SYBR Green I,使得阳性结果的绿色很明显区别于阴性结果橙色,能够快速便捷的观察检测结果。(2)针对细菌在低温和贫营养条件下不能增殖因而造成漏检的问题,建立了原位恒温核酸扩增方法,实现靶序列在恒温65℃条件下单细胞内原位大量扩增。结果表明:较低的反应温度减轻了对细胞结构的损坏,细胞完整固定在载玻片上,无脱落现象,获得的图像背景对比度很强;检测沙门氏菌与大肠杆菌的混合菌时,通过绿光的激发,标记有荧光信号的沙门氏菌被特异性检测出来;检测人工模拟污染样品时,检测结果没有受到杂质的影响,倒置荧光显微镜下可以检到单个细胞;通过与PCR方法和环介导恒温核酸扩增方法进行比较能够发现,该方法灵敏度高于PCR方法,并与环介导恒温核酸扩增方法相当,但是,它的检测限可以达到单个细胞并且可以更直观的观察到细胞存在状态,且不用进行核酸提取,大大省略了人为操作带来的误差。