【摘 要】
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背景丙烯酰胺（acrylamide,ACR）是一种易溶于水无色无味的化合物,也是常见的工业生产原料及实验室试剂,它广泛存在于印刷、纺织以及实验室等环境中,除此之外,淀粉类食物等在高温（120℃）烹饪下也会通过美拉德反应也产生丙烯酰胺。而它本身是一种细胞毒性物质,被列为2类致癌物,还具有神经毒性、免疫毒性以及生殖发育毒性。研究发现丙烯酰胺暴露条件下,雄性小鼠的生育能力会有所损伤,具体表现为睾丸组织受
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背景丙烯酰胺（acrylamide,ACR）是一种易溶于水无色无味的化合物,也是常见的工业生产原料及实验室试剂,它广泛存在于印刷、纺织以及实验室等环境中,除此之外,淀粉类食物等在高温（120℃）烹饪下也会通过美拉德反应也产生丙烯酰胺。而它本身是一种细胞毒性物质,被列为2类致癌物,还具有神经毒性、免疫毒性以及生殖发育毒性。研究发现丙烯酰胺暴露条件下,雄性小鼠的生育能力会有所损伤,具体表现为睾丸组织受损、生精功能减弱、睾酮分泌减少等等。有文献指出ERK通路参与氧化应激过程,还与类固醇合成急性调节蛋白（St AR）有关。因此本实验探讨的是ERK1/2信号是否参与了丙烯酰胺诱导的小鼠睾酮分泌减少的过程。目的研究丙烯酰胺暴露条件下,小鼠睾酮合成功能的受损情况,以及睾酮分泌减少与ERK 1/2信号的内在联系。方法将16只8周龄雄性C57小鼠随机分为四组,分别腹腔注射生理盐水以及不同浓度的ACR 14天,分别是对照组（生理盐水;Control）、低剂量组（ACR:10mg/kg/d;Low-Dose,L-D）、中剂量组（ACR:20mg/kg/d;Middle-Dose,M-D）、高剂量组（ACR:40mg/kg/d;High-dose,H-D）.记录小鼠每日体重变化,14天后脱颈椎处死小鼠,收集血液并提取血清进行睾酮含量的检测;释放精子并对精子进行计数,附睾固定后进行H-E染色,评价丙烯酰胺对精子数目的影响;睾丸固定后进行H-E染色判断丙烯酰胺对其显微结构的影响;对睾丸组织进行HSD-3β染色以对小鼠睾丸间质细胞进行计数;对睾丸组织进行TUNEL染色评价其凋亡情况。在进行CCK-8试剂盒对丙烯酰胺浓度的筛选后,给予不同浓度ACR（0、1.25、2.5、5、10（μM））处理TM3细胞24小时,使用Annexin V-FITC检测不同浓度丙烯酰胺处理后的TM3细胞的凋亡情况;使用活性氧（ROS）试剂盒检测其各组ROS含量判断各组氧化应激水平;检测细胞培养后上清液中睾酮水平。对TM3细胞以及小鼠睾丸组织进行PARP1蛋白相对表达情况的检测以比较DNA的受损程度及凋亡情况;对睾酮合成相关酶Cytochrome P450 Family 11Subfamily A Member 1（CYP11a1）、Cytochrome P450 Family 17 Subfamily A Member 1（CYP17a1）、类固醇合成急性调节蛋白（steroidogenic acute regulatory protein,St AR）蛋白或基因相对表达量进行检测,判断丙烯酰胺作用下其睾酮的合成能力;也检测ERK1/2及P-ERK1/2、AKT及P-AKT蛋白的相对表达量以体现丙烯酰胺毒性作用的分子机制。结果与对照组相比,ACR染毒组出现了明显的体重下降、睾丸和附睾重量降低的情况;中、高剂量ACR组睾酮含量也显著下降;随着丙烯酰胺暴露浓度的上升,H-E染色后发现附睾管内精子数目下降,睾丸组织也逐渐出现损伤,生精小管基底膜出现波纹,各级生精细胞减少,精子数目减少,小管外睾丸间质细胞减少,睾丸的HSD-3β染色也可以证明小鼠睾丸间质细胞的减少;Tunel染色中ACR染毒组平均荧光强度的升高证明了其凋亡在加重。不同浓度ACR处理TM3细胞后,Annexin V-FITC检测出染毒组凋亡相比于对照组增多;ACR染毒后TM3细胞内ROS增多,氧化应激增强;相比较于对照组,ACR染毒组培养基上清中睾酮水平呈现下降趋势。动物实验中相比较于对照组,染毒组CYP11a1、CYP17a1、St AR的蛋白相对表达量显著降低,细胞实验中,染毒组CYP17a1、的蛋白相对表达量也显著降低,同时动物和细胞实验中,染毒组的ERK1/2的磷酸化水平均显著上升,AKT及其磷酸化没有明显变化。结论丙烯酰胺暴露条件下,小鼠睾丸、附睾结构和功能受损,睾丸间质细胞的睾酮合成能力明显下降,分泌睾酮含量减少,这一过程可能与ERK1/2被过度激活有关。
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