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探讨心肌细胞缺氧、缺血后心肌细胞凋亡和凋亡相关基因表达的变化，进一步研究Caspase-3特异性抑制剂和体外传染Bcl-2基因对心肌细胞凋亡的影响，并探讨其可能机制。第一部分：缺氧诱导培养乳鼠心肌细胞凋亡的实验研究目的：建立一种改进的体外培养乳鼠心肌细胞的缺氧、缺血模型，探讨心肌细胞缺氧、缺血损伤后的心肌细胞凋亡及其时序分布特点。方法：SD乳鼠的培养心肌细胞置于缺氧、缺血以及酸化的培养基中12-72小时，随机分为：对照组，缺氧12小时组(I12h)，缺氧24小时组(I24h)，缺氧48小时组(I48h)以及缺氧72小时组(I72h)。检测各时点培养基的pH值以及PO2，并检测分析各时点心肌细胞CPK和ATP酶活性变化；应用TUNEL染色、流式细胞术、DNA琼脂糖凝胶电泳、单细胞电泳和透射电镜等手段检测心肌细胞凋亡的改变。结果：在本实验的心肌细胞缺氧、缺血模型中，心肌细胞孵育液的PO2和pH值随缺氧时间的延长逐渐下降（P＜0.01），并导致了严重的心肌细胞损伤。随缺氧时间的延长，TUNEL阳性细胞数量逐渐增多，各时点的心肌细胞凋亡指数（AI）均比对照组明显增多（P＜0.01）；凋亡心肌细胞在缺氧48—72h最多见；缺氧后心肌细胞凋亡百分率迅速增高（P＜0.01）；心肌细胞在缺氧48h、72h时均出现了凋亡特异性的“梯状”电泳带。单细胞电泳分析，缺氧12小时后，可见心肌细胞DNA损伤，慧星样细胞出现率、慧尾长度和尾距均明显增加（P＜0.01），并呈现明显的时间—效应依赖性趋势。结论：上述结果提示培养乳鼠心肌细胞缺氧模型可导致心肌细胞凋亡，凋亡程度和心肌细胞缺氧时间有关，并可导致和在体心肌缺血相似的心肌损伤，包括：同时发生的心肌细胞坏死，细胞内ATP的降解，心肌博动功能的丧失。单细胞casP“e一3抑制剂及外源性Bcl一2时缺氧/缺血心肌细胞凋亡的实验研究摘要电泳与LSCM相结合分析可更早期、灵敏地检测缺氧引起的心肌细胞DNA损伤，并在心肌细胞凋亡的鉴别中有重要意义。第二部分:缺氧诱导的心肌细胞凋亡相关基因表达的实验研究 目的:探讨缺氧诱导乳鼠的培养心肌细胞凋亡中，凋亡相关基因表达的变化规律及其与心肌细胞凋亡发生发展的关系。 方法:SD乳鼠的培养心肌细胞置于缺氧、缺血以及酸化的培养基中12一72小时，随机分为:对照组，缺氧12小时（I:Zh）、24小时（I24h）、48小时（I4sh）以及72小时组（Iv2h）。利用免疫组织化学技术、Westem印记分析法和逆转录PCR技术，检测心肌细胞Caspase一3、Bcl一2、Bax蛋白和m州A的表达;借助caspase一3荧光分析试剂盒，荧光比色法检测casPase一3活性的变化;同时应用原位末端标记和流式细胞术检测心肌细胞凋亡的变化。 结果:TUNEL检测发现，随缺氧时间的延长，TLJNEL阳性细胞数量逐渐增多，各分析时点心肌细胞凋亡指数（AD与对照组相比均有明显差异（P<0 .01）。心肌细胞缺氧后细胞凋亡百分率迅速增高（P<0 .01）。随缺氧时间的延长，Caspase一3阳性心肌细胞逐渐增多，Bcl一2阳性心肌细胞百分率逐渐降低，Bax阳性细胞数明显增多，与对照组相比均有显著性差异（P<0.01）。westem blot检测显示，缺氧后各组Caspase一3的17KD活性亚单位表达均增强（P<0.01）;Bcl一2的26KD活性亚单位表达均减弱（P<0.01）;Bax ZIKD活性亚单位表达均增强（P<0.01）。心肌细胞缺氧后各组与对照组相比Caspase一3 mRNA的表达明显增高伊<0.01），Bcl一2mRNA的表达明显减少（P<0.01），而Bax InRNA的表达明显增高（P<0.01）。caspase一3活性检测显示，缺氧后各时点的Caspase一3活性迅速上升（P<0.01）。 结论:缺氧后心肌细胞凋亡的发生与Caspase一3的激活有关，缺氧对Caspase一3的调节发生在转录水平以前的某一环节，Bcl一2、Bax参与了缺氧诱导的心肌细胞凋亡。第三部分:体外转染Bcl一2基因对缺氧诱导的心肌细胞凋亡的影响 目的:探讨Bd一2基因过表达对缺氧诱导的心肌细胞凋亡及凋亡相关基因的 影响。 方法:将培养的乳鼠心肌细胞随机分为3组:对照组、缺氧72小时组（玩h）、公casPase一3抑制剂及外源性Bcl一2对缺氧/缺血心肌细胞调亡的实验研究摘要Bcl一2基因转染组。应用免疫组织化学技术、W七stem印记分析法和逆转录PCR技术，检测心肌细胞Caspase一3、Bcl一2蛋白和mRNA的表达;借助casPase一3荧光分析试剂盒，荧光比色法检测caspase一3活性的变化:同时应用原位末端标记和流式细胞术检测心肌细胞凋亡的变化。 结果:Bcl一2基因转染组的心肌细胞凋亡指数（Al）和心肌细胞凋亡百分率与I72h组相比明显降低（P<0.01）。Bcl一2基因转染组的caspase一3阳性细胞数、easpase一3 mRNA和easpase一3蛋白表达比I72h组显著减少（P<0.01）。Bel一2基因转染组的Bcl一2阳性细胞数、Bcl一2 mRNA和Bcl一2蛋白表达比玩，组明显增加 （P<0 .01）。caspase一3活性检测显示，Bcl一2基因转染组的caspase一3活性与玩h组相比明显降低（P<0.01）。 结论:po灯5一mBcl一Za质粒载体能成功转染培养的心肌细胞;外源性Bcl一2基