禽致病性大肠杆菌病（Avian Pathogenic Escherichiacoli, APEC）是引起禽类高死亡率的重要传染病之一，给养禽业的发展带来了严重危害。而耶尔森菌强毒力岛(high pathogenicity island, HPI)是决定包括APEC在内的多种肠道致病菌毒力和致病性的一个较大的染色体片段。有研究表明，irp2和fyua基因与铁的摄取有关，是HPI的核心结构和功能基因，但是有关其与APEC毒力之间的关系并未见详细报道。　　本研究从HPI的主要结构基因irp2、fyua入手，分别构建了禽致病性大肠杆菌irp2和irp2/fyua基因缺失株，并研究基因缺失对其毒力因子转录水平、黏附DF-1细胞能力、半数致死量以及感染雏鸡病理变化的影响，进而揭示了irp2、fyua基因与APEC毒力之间的关系，为后续进一步明确HPI对APEC毒力的影响奠定一些基础。具体的研究内容和结果如下：　　1、禽致病性大肠杆菌irp2和irp2/fyua缺失株的构建　　本实验利用Red同源重组技术对目的基因irp2、fyua进行了分步缺失。首先将irp2基因的同源臂克隆至零背景克隆载体，然后将pKD3质粒上的氯霉素抗性片段克隆插入到零背景载体中，形成用于Red同源重组的打靶序列。利用Red同源重组原理30℃表达出诱导蛋白，将该打靶序列的PCR产物电转化至目的菌中，从而实现基因的互换。利用氯霉素的抗性标记筛选出重组成功的菌株，并将pCP20质粒电转至阳性菌株用于氯霉素抗性的消除，这样就成功获得irp2单基因缺失株。以irp2单基因缺失株为出发株，利用同上的方法，进行fyua基因的缺失，成功获得irp2/fyua双基因缺失株。　　2、禽致病性大肠杆菌irp2缺失对其毒力的影响　　本实验分别从RT-PCR法检测毒力基因的转录水平、生长曲线的测定、对DF-1细胞黏附力的比较、LD50的测定、感染动物病理组织切片的观察等方面探索了HPI毒力岛 irp2的缺失对禽致病性大肠杆菌毒力的影响。Real-time PCR结果显示，与野生株相比，irp2缺失株的luxS，iss,ompA和 fimC等4个毒力基因的转录水平均极显著下降（P＜0.01）。生长曲线的测定显示，irp2的缺失对禽致病性大肠杆菌在LB培养基的培养条件下生长不会造成影响。对鸡胚层纤维细胞DF-1细胞的黏附结果显示，irp2的缺失使APEC的黏附能力下降为野生株的66.0％。罗曼雏鸡的半数致死量检测结果显示，irp2的缺失使APEC的毒力下降了34倍。心脏和肝脏的病理组织切片显示，野生株攻毒后，罗曼雏鸡的心包膜附近出现了大量的炎性细胞浸润，肝脏周围附近有炎性细胞聚集。而irp2缺失株攻毒后所引起的雏鸡病理变化明显减轻。　　3、禽致病性大肠杆菌irp2/fyua缺失对其毒力的影响　　本实验分别从RT-PCR法检测毒力基因的转录水平、生长曲线的测定、对DF-1细胞黏附力的比较、LD50的测定、感染动物病理组织切片的观察等方面探索了HPI毒力岛irp2/fyua的缺失对禽致病性大肠杆菌毒力的影响。Real-time PCR结果显示，与野生株相比，irp2/fyua缺失株的luxS,pfs,tsh,iss,ompA和fimC等6个毒力基因的转录水平极显著的下降（P＜0.01）。生长曲线的测定显示，irp2/fyua的缺失对禽大肠杆菌在LB培养基的培养条件下生长不会造成影响。对鸡胚层纤维细胞DF-1细胞的黏附结果显示，irp2/fyua基因的缺失使APEC的黏附能力下降为野生株的53.5%。irp2/fyua缺失株和irp2缺失株相比，黏附能力下降为后者的14.7倍。罗曼雏鸡的半数致死量检测结果显示，irp2/fyua的缺失使APEC的毒力下降了500倍。罗曼雏鸡心脏和肝脏的病理组织切片显示，irp2/fyua缺失株攻毒后所造成的雏鸡病理变化不明显。　　通过Red同源重组成功获得APEC irp2和irp2/fyua缺失株，同时irp2和irp2/fyua缺失株的毒力研究结果表明，irp2和irp2/fyua的缺失会引起APEC一些毒力因子表达水平的下降、黏附DF-1能力的减弱、LD50的下降以及感染动物病理变化的减轻等。以上结果表明也进一步表明irp2和 fyua对于APEC的毒力有着重要的调控作用，为后续明确HPI对APEC的调控作用提供一些参考。