论文部分内容阅读
近年来,深部真菌感染疾病的感染率逐渐提高,对患者的健康和生命造成了很大的威胁。课题组筛选得到一株芽孢杆菌,能产生核苷嘧啶类抗真菌抗生素,对引起深部真菌感染的白色念珠菌具有很好的抑制作用。论文在研究该抗生素发酵工艺基础上,重点研究该抗生素的分离纯化工艺,为该抗生素的进一步开发和利用奠定了基础。本论文首先对该抗生素的摇瓶培养工艺进行了优化,确定了较优的发酵条件:pH 6.5,接种量8%,转速200 r/min,装液量40mL/250 mL,28℃下摇瓶发酵48h后产抗水平最高达到940.35 U/mL;进一步在通气搅拌罐中进行了放大,在摇瓶得到的优化条件的基础上,在通气量为2 vvm,搅拌转速200 r/min,装液量60%（v/v）条件下,培养36h后产抗水平达到最高,达到950.5 U/mL,比摇瓶培养略有提高。论文对抗生素发酵液的理化性质作了简单的考察,结果表明:该抗生素具有较强的热稳定性;在酸、中性环境下比较稳定,碱性环境下不稳定;低温条件下（-20℃）,该抗生素发酵液放置时间在9天以内均可保持较高的活性;该抗生素对光照不敏感;是一种极性酸性水溶性抗生素。在以上研究基础上,论文重点研究了该抗生素的分离纯化工艺条件。本论文建立的抗生素分离工艺为:发酵液絮凝预处理→调发酵液pH 2.0→H41大孔树脂脱色→HD-8离子交换树脂纯化→（制备高效液相精制）→冻干。通过对工艺条件的优化,实现该抗生素的分离和纯化。本工艺路线首先采用了壳聚糖絮凝除菌,优化后的条件为:pH 2.0、絮凝剂用量为0.4g/L、温度为30℃,絮凝率达到84.6%;以草酸和盐酸为沉淀剂,分别在pH 4.0和2.0下沉淀发酵液中的金属离子和杂蛋白;大孔吸附树脂H41对发酵液进行脱色,脱色条件为:pH为2.0的发酵液以2 BV/h的流速上柱,脱色率达到95.1%,抗生素效价提高到2332.18 U/mL;选取了阳离子树脂HD-8作离子交换层析实验,优化后的工艺条件为:pH为2.0的上柱液以2 BV/h的流速上柱,在吸附达到平衡后用去离子水冲洗后,再用0.6mol/L的NH3·H2O以4 BV/h的流速洗脱。洗脱液减压蒸馏,冷冻干燥,得到淡黄色粉末,效价提高到5855.5 U/mg。整个分离过程的总收率为63.4%。HPLC检测离子交换分离得到的产品,归一法测定其纯度为70.24%;抗生素粗品经制备HPLC精制后,纯度达到95.75%,最终效价达到8280.5 U/mg。经质谱分析,其分子量为520.68。紫外扫描发现该抗生素在298 nm处有强吸收峰。对酵母类真菌具有较好的抑菌效果,抗生素粗品对白色念珠菌的最小抑菌浓度（MIC）为0.1807μg/mL。