【摘 要】
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目的:明确MAGED4与miR-891b/miR-194-5p之间是否存在直接靶向关系,探究miR-891b/miR-194-5p是否通过MAGED4影响胶质瘤的迁移和侵袭。方法:（1）生物信息学分析借助miRBase、Target Scan及miRanda三大数据库,预测潜在靶向MAGED4的miRNA及其潜在的结合位点;通过CGGA数据库分析目的miRNA在胶质瘤组织表达的临床意义。（2）目的
【基金项目】
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项目名称:miRNA靶向MageD4抑制胶质瘤迁移侵袭的分子机制研究,项目合同编号:2017GXNSFAA198001,项目来源:广西自然基金,项目起止时间:2017.09-2020.8；
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目的:明确MAGED4与miR-891b/miR-194-5p之间是否存在直接靶向关系,探究miR-891b/miR-194-5p是否通过MAGED4影响胶质瘤的迁移和侵袭。方法:（1）生物信息学分析借助miRBase、Target Scan及miRanda三大数据库,预测潜在靶向MAGED4的miRNA及其潜在的结合位点;通过CGGA数据库分析目的miRNA在胶质瘤组织表达的临床意义。（2）目的miRNA与MAGED4调控关系的验证①目的miRNA上调和下调胶质瘤细胞株的构建:首先通过qRT-PCR检测目的miRNA在五株胶质瘤细胞株U87、U251、A172、SF126以及SF763中的表达,为后续实验筛选合适的细胞株;然后将外源性目的miRNA的模拟物（mimics）或抑制剂（inhibitors）分别转入所选的胶质瘤细胞株,qRTPCR确认目的miRNA的上调或下调效率。②目的miRNA对MAGED4表达的影响:qRT-PCR和WB检测目的miRNA上调和下调胶质瘤细胞株中MAGED4 mRNA与蛋白的表达水平。③目的miRNA与MAGED4的直接靶向作用:构建MAGED43/UTR野生型（Wild Type,WT）与突变型（Mutant Type,MUT）双荧光素酶报告基因载体,分别转入HEK-293T和胶质瘤细胞中,检测荧光素酶活性。（3）目的miRNA对胶质瘤细胞迁移和侵袭的影响①划痕愈合实验与Transwell迁移实验分别检测目的miRNA上调和下调胶质瘤细胞的水平和垂直迁移能力;②Transwell侵袭实验检测目的miRNA上调和下调胶质瘤细胞的侵袭能力;③Martrigel黏附实验检测目的miRNA上调和下调胶质瘤细胞的黏附能力;④Western blot检测上皮-间质转化相关分子。（2）目的miRNA是否通过靶向MAGED4影响胶质瘤的迁移和侵袭目的miRNA mimics/inhibitors与MAGED4表达/干扰载体共转胶质瘤细胞株,了解MAGED4能否回复目的miRNA对胶质瘤细胞迁移和侵袭的影响。结果:（1）生物信息学预测结果显示:MAGED4是miR-891b/miR-194-5p潜在的靶基因,miR-891b与MAGED4的潜在结合位点为UUCAACG,miR-194-5p与MAGED4的潜在结合位点为ACAAUG;CGGA数据库分析结果显示:miR-891b的表达与患者性别、异柠檬酸脱氢酶（IDH）突变状态、WHO Ⅲ胶质瘤生存相关（P＜0.05）;而miR-194-5p的表达则与组织类型、WHO分级、化疗状态、MGMT甲基化以及胶质瘤的生存期相关（P＜0.05）。（2）成功构建了miR-891b/miR-194-5p上调和下调的U87、U251和SF763胶质瘤细胞株;进一步检测其MAGED4表达,结果显示:当miR-891b/miR-194-5p上调时,三株胶质瘤细胞MAGED4 mRNA和蛋白的表达均受到抑制;而当miR-891b/miR-194-5p表达下调时,三株胶质瘤细胞MAGED4 mRNA和蛋白的表达均升高（P＜0.05）;继而荧光素酶实验结果证实:MAGED4是miR-891b/miR-194-5p的直接靶基因。（3）细胞生物学行为检测实验结果显示:上调miR-891b/miR-194-5p可抑制U87、U251和SF763细胞的迁移、侵袭和黏附能力,且E-钙粘蛋白表达升高,而N-钙粘蛋白表达下降;反之,下调miR-891b/miR-194-5p增强U87、U251和SF763细胞的迁移、侵袭和黏附能力,且E-钙粘蛋白表达降低,而N-钙粘蛋白表达升高。这些结果提示miR-891b/miR-194-5p具有抑癌基因特性,抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭等恶性生物学行为。（4）回复实验结果表明:MAGED4过表达可以逆转上调的miR-891b/miR-194-5p对胶质瘤细胞迁移、侵袭和黏附的抑制作用;相反,MAGED4沉默可以逆转下调的miR-891b/miR-194-5p对胶质瘤细胞迁移、侵袭和黏附的促进作用。结论:胶质瘤中miR-891b/miR-194-5p靶向抑制MAGED4表达,MAGED4是miR-891b/miR-194-5p的直接靶基因,miR-891b/miR-194-5p通过MAGED4抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭等恶性生物学行为。
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