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目的：糖尿病肾病（diabetic nephropathy， DN）是糖尿病（diabetesmellitus，DM）最严重的并发症之一，也是导致慢性肾衰竭的主要原因之一。其发病机制复杂，近些年慢性炎症反应在DN中的作用机制备受关注。Toll样受体4（Toll-like receptor4，TLR4）在介导多种细胞的信号激活及炎症反应中发挥重要作用，目前其在DM和DN发病中的作用逐渐受到关注，临床和实验研究中均证实高糖状态下多种细胞TLR4的表达显著升高，但是TLR4升高在DM及DN发生发展中的详细机制尚未完全阐明。因此，本课题依据文献和前期实验结果，拟通过体内、体外研究高血糖状态下高表达的TLR4，在不同配体的刺激下对肾小管上皮细胞、巨噬细胞炎症因子的产生的影响，探讨TLR4激活在DN发病中的作用机制，以及对巨噬细胞募集、肾组织纤维化等的调节作用，从而提出新的针对DN炎症反应的治疗策略，为DN免疫治疗提供实验依据。方法：1研究高糖对HK-2和THP-1细胞TLR4表达及炎症反应的影响：用含不同浓度葡萄糖的1640培养基培养HK-2和THP-1细胞，用免疫荧光技术和流式细胞仪检测细胞表面TLR4的表达水平。分别用LPS和HSP60刺激含不同浓度葡萄糖培养的细胞，在不同时间段（2、4、6、8h）收集细胞，Real-time PCR检测炎症因子（TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-8）mRNA表达。2研究巨噬细胞激活后上清对HK-2细胞的影响：用LPS刺激THP-1后的上清液作用于HK-2细胞，观察炎症因子的产生。THP-1细胞用高糖培养基培养，经LPS刺激24h后取上清与高糖培养基培养的HK-2细胞混合，在不同时间点收集细胞，Real-time PCR检测HK-2细胞mRNA表达；Western blot检测NF-κBp65表达水平；免疫组化检测FN表达水平。3制备2型糖尿病大鼠模型：腹腔注射低剂量STZ（45mg/kg），72h后取尾静脉血测定血糖，两次检测浓度均大于16.7mmol/L时为造模成功。4动态观察DM大鼠腹腔巨噬细胞激活的炎症反应：在DM的2、4、8、12w取大鼠腹腔巨噬细胞，用LPS刺激2、4、6h后收集细胞，Real-timePCR检测TNF-α和IL-1β表达水平;在DM的2、4、8、12w取大鼠腹腔巨噬细胞，分别用LPS、HSP60刺激48h后收集上清，ELISA检测上清中TNF-α和IL-1β的水平。5动态观察DM大鼠的肾脏的炎症反应：在DM的2、4、8、12w取大鼠肾脏，Real-time PCR检测TLR-4、TNF-α和IL-1β表达水平；取肾脏做组织切片，HE染色观察肾脏病变；免疫组化检测FN的表达。结果：1高糖环境能促进人单核巨噬细胞THP-1和肾小管上皮细胞HK-2表面TLR4表达。2高糖环境下的HK-2和THP-1细胞经LPS和HSP60刺激后TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-8mRNA的表达均显著高于对照组。3经LPS刺激过的THP-1细胞培养上清液作用于HK-2细胞后，实验组TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-8mRNA的表达均显著高于空白对照组和高糖对照组；Western Blot结果显示：上清液作用HK-2细胞72小时后NF-κBp65的表达量要显著增高；不同浓度的THP-1刺激上清液作用于HK-2细胞48h后，细胞免疫组化结果显示：40%的刺激上清液作用于HK-2细胞FN的表达量显著增高。4成功建立了2型糖尿病大鼠模型。5Real-time PCR检测经LPS刺激的大鼠腹腔巨噬细胞TNF-α、IL-1βmRNA表达水平。结果显示：DM组腹腔巨噬细胞TNF-α，IL-1β表达量的高峰值出现在LPS刺激后两小时，且随着DM大鼠时间的延长，刺激2h的表达量逐渐增高。6ELISA检测结果显示：DM组2、4、8、12w获取的巨噬细胞经HSP60和LPS刺激后24h，TNF-α的表达量逐渐增高，分别在8w、12w高峰值，可达到600pg/ml左右； IL-1β的表达量也逐渐增高，均在8w达到高峰值，可达到700pg/ml左右。72型糖尿病大鼠模型建立成功后，在不同时期取大鼠肾脏，Real-timePCR检测TLR4，TNF-α，IL-1β mRNA表达水平。结果显示：DM组12wTLR4的表达水平明显高于同时期对照组，也高于DM组的其它时期；DM组的不同时期TNF-α表达水平与同时期对照组相比均有明显增高，DM组12w TNF-α的表达水平显著高于同组其它时期；DM组的不同时期IL-1β表达水平与同时期对照组相比均有明显增高，DM组8w、12w IL-1β的表达水平都要显著高于同组2w、4w的表达水平。8肾脏组织HE染色结果显示：从DM4w开始，肾脏组织开始有少量的炎症细胞浸润，肾间质出现轻微的纤维化，8w、12w时，浸润肾脏的炎症细胞逐渐增多，肾脏纤维化逐渐增强。9肾脏组织免疫组化结果显示：纤维连接蛋白FN在DM4w时开始表达，随着病情的进展，FN表达逐渐增强，12w表达量最多。结论：1高糖环境可以诱导THP-1和HK-2细胞TLR4表达增加，且LPS和HSP60均可促进高糖环境中的THP-1和HK-2细胞炎症因子高表达。2THP-1培养上清液作用于HK-2细胞可引起更加强烈的炎症反应，且促进HK-2细胞纤维连接蛋白FN的高表达。3随着大鼠糖尿病病程的进展，腹腔巨噬细胞经LPS和HSP60刺激的炎症因子表达量逐渐增加，肾脏TLR4和炎症因子（TNF-α和IL-1β）mRNA的表达逐渐增加。4随着大鼠糖尿病病程的进展，肾脏的纤维化和炎症侵润逐渐加剧。