论文部分内容阅读
【背景】流感病毒周期性暴发造成严重经济损失与社会影响。面对随时可能发生的流感大流行,目前的抗流感药物略显匮乏,且由于现有抗流感药物的临床耐药性问题,新型抗流感病毒药物的研发愈发迫切。流感病毒聚合酶是由PB1、PB2和PA亚基组成的异源三聚体,高度保守且相互作用紧密,在病毒复制周期与病毒毒力维持中十分重要。其中PB2亚基具有帽结合位点,可特异性结合宿主的mRNA前体的5’帽并为有帽依赖核酸内切酶活性的PA亚基提供酶切位点,这个帽抢夺过程为病毒RNA转录提供引物以启动转录。PB2及PA在病毒RNA启动转录过程中起重要作用,据报道PB2亚基比HA和NA表现出更小的变异率,因此PB2亚基是前景良好的抗流感药物设计靶点。目前基于聚合酶PB2亚基的小分子药物为吡莫地韦。吡莫地韦是第一个PB2帽结合域抑制剂,但其联合标准治疗治疗住院流感患者的Ⅲ期临床研究因没有明显额外临床效益而被终止,研发新的抗流感药物仍是重大需求。【目的】本研究基于PB2抑制剂VX-787的化学结构经过合理分子设计得到一种新嘧啶衍生物ZSP-1273,通过体外研究证实其对甲型流感病毒具有显著抗病毒活性（包括OSE耐药株）,同时在致死性甲型流感病毒感染小鼠模型上发现ZSP-1273感染36 h后给药可完全防止病毒感染小鼠死亡,且改善甲型流感病毒感染小鼠的体重减轻和降低肺病毒载量。基于这些研究发现,本研究通过建立甲型流感病毒聚合酶PB2帽结合域与小分子化合物相互作用方法来确证ZSP-1273的作用靶点,并对其作用机制进行探索。【方法】一、通过CPE抑制实验和空斑形成抑制实验评估ZSP-1273对甲型流感病毒的体外抑制活性。同时通过致死性A/WSN/33感染小鼠模型评价ZSP-1273对甲型流感病毒的体内抑制活性。二、通过基于双荧光素酶报告基因的流感病毒minigenome系统评估了ZSP-1273对IAV聚合酶复合物的抑制活性。三、通过qPCR和western blotting实验评估ZSP-1273对IAV聚合酶PB2亚基体外mRNA及蛋白表达水平的抑制活性。四、通过原核蛋白表达系统,表达纯化甲型流感病毒A/Puerto Rico/8/1934（H1N1）的PB2（247-536）蛋白用于后续相互作用实验.五、利用C10接口将m7-GTP固定在琼脂树脂上,在存在/不存在小分子化合物的情况下,通过SDS-PAGE电泳定量结合在树脂上的PB2蛋白。六、通过Octet分子互作仪检测PB2（247-536）蛋白与小分子化合物相互作用。将生物素标记的蛋白固化在SSA传感器后进行蛋白与小分子结合,进而通过得到的动力学参数定量蛋白与小分子化合物的结合情况。七、通过等温滴定热分析实验检测PB2（247-536）蛋白与小分子化合物相互作用。在25℃下通过样品针中溶解在同一缓冲液中的小分子化合物溶液滴定量热池中的蛋白质溶液。对照实验使用相同的设置,但只有缓冲液在量热池或样品针中只有缓冲液。对照组产生的热效应小且恒定,因此从样品结果中减去平均注入热。通过得到的热力学参数定量蛋白与小分子化合物的结合情况。【结果】一、通过CPE抑制实验发现ZSP-1273对多株IAV毒株具有显著体外抑制活性且优于VX-787和OSE,其对OSE耐药毒株也具有同等水平的体外抑制活性。另外,在致死性A/WSN/33感染小鼠模型上发现ZSP-1273对IAV感染小鼠具有显著死亡保护作用且优于VX-787和OSE。对于IAV感染导致的体重减轻,ZSP-1273同样具有显著保护作用,效果于VX-787相当,优于OSE,且与VX-787一样可以加快IAV感染小鼠的体重回升。同时ZSP-1273可以显著降低IAV感染诱导小鼠上升的肺病毒滴度,且同等剂量（30 mg/kg）下优于VX-787。二、通过基于双荧光素酶报告基因的流感病毒minigenome系统证明了ZSP-1273对IAV聚合酶复合物存在显著抑制作用,IC50为0.562±0.116 nM,与VX-787对IAV聚合酶复合物的抑制活性相当（1.449±0.34 nM）,二者抑制活性均强于T-705。同时通过qPCR和western blotting实验评估ZSP-1273对IAV聚合酶PB2亚基体外mRNA及蛋白表达水平的抑制活性,发现ZSP-1273和VX-787均能显著抑制IAV感染诱导A549细胞升高的PB2 mRNA水平和蛋白表达水平。三、通过ITC实验证明了ZSP-1273与IAV聚合酶PB2 CBD之间存在紧密结合左右,两者之间的结合是由熵驱动的自发放热反应,过程中静电作用力占据主导作用,结合的KD值为23.7 nM。【结论】ZSP1273是一种基于PB2抑制剂VX-787结构通过合理分子设计而来的新型抗流感病毒嘧啶衍生物,通过体外实验发现其对IAV具有显著抑制活性,进一步通过致死性IAV感染小鼠模型的实验表明其具有良好体内抗病毒活性。本课题通过ITC实验证明ZSP-1273与PB2帽结合域之间存在紧密相互作用,为其作为新型流感病毒聚合酶PB2亚基抑制剂提供新的证据支持。但是还需要进一步对二者的共晶体结构进行解析,这对明确ZSP-1273的抗病毒活性以及阐明其抗病毒机制是不可或缺的。