论文部分内容阅读
研究背景足细胞是一种高度分化的非典型的上皮细胞,位于肾小球最外层,与肾小球内皮细胞及基底膜共同组成肾小球的滤过屏障,维持肾脏滤过功能。足细胞损伤是多种肾小球疾病的早期事件,也是引起蛋白尿、肾小球纤维化、弥散性系膜硬化以及肾单位丢失等多种肾脏损伤的重要原因,参与了糖尿病肾病（diabeticnephropathy,DN）、局灶性节段性肾小球硬化（focal segmental glomerulosclerosis,FSGS）、膜性肾病（membranous glomerulonephritis,MGN）等多种慢性肾病（chronic kidney disease,CKD）的病理生理过程。足细胞损伤的机制十分复杂,自噬、炎症反应、氧化应激、细胞衰老以及糖脂代谢紊乱等参与其中,越来越多的研究显示表观遗传学调控在足细胞维持正常的结构与功能中发挥重要作用,因此找到参与足细胞损伤的关键表观遗传调控分子,用于肾小球疾病的防治,具有重要的理论意义和临床应用价值。表观遗传调控存在多种形式,DNA甲基化与组蛋白甲基化等表观遗传调控在足细胞损伤研究领域受到广泛关注。核蛋白UHRF1（ubiquitin-like containing PHD and ring finger 1）是UHRF家族的一员,其包含多个结构域,参与DNA甲基化及组蛋白甲基化等多种表观遗传调控。尽管已有研究表明UHRF1在癌症、动脉粥样硬化及生殖细胞形成中发挥重要作用,但其是否参与足细胞损伤尚未见报道。因此本课题旨在探索UHRF1在足细胞损伤中的作用并对机制进行初步研究,以期揭示表观调控在足细胞损伤相关肾小球疾病中的作用。研究目的1.明确UHRF1在足细胞损伤中的表达模式。2.阐明UHRF1在足细胞损伤中的功能与作用。3.初步探讨UHRF1参与足细胞损伤的机制。研究方法和结果第一部分:UHRF1在足细胞损伤相关肾小球疾病中的表达变化1.1构建单纯高脂诱导的肾小球疾病模型购买8周龄雄性野生型（wild type,WT）C57BL/6J小鼠构建足细胞损伤相关肾病模型,单纯60%高脂（high fat diet,HFD）饲料喂养9个月建立肾脏损伤模型。1.2构建2型糖尿病肾病模型链脲佐霉素（streptozotocin,STZ）联合HFD诱导2型糖尿病肾病模型;购买db/m鼠进行繁育,以后代db/db鼠作为自发性2型糖尿病肾病模型,以db/m鼠作为对照。1.3阿霉素诱导的局灶性节段性肾小球硬化模型的构建购买8周龄雄性WT小鼠,尾静脉注射阿霉素（adriamycin,ADR）（15 mg/kg）后,小鼠饲养6周,模拟局灶性节段性肾小球硬化症（focal segmental glomerulosclerosis,FSGS）。1.4 UHRF1在足细胞损伤相关肾小球疾病中表达显著降低当模型构建成功后,使用蛋白免疫印迹法（Western blot,WB）,免疫组化（immunohistochemistry,IHC）检测UHRF1的表达情况,结果显示与各自的对照组相比,HFD诱导、db/db、STZ/HFD、以及阿霉素诱导的肾病小鼠的肾皮质中UHRF1的蛋白表达显著下降,进一步UHRF1和足细胞标记蛋白威尔姆斯瘤1（wilms tumor 1,WT1）进行免疫荧光（immunofluorescence,IF）双染,结果显示在足细胞中,UHRF1的表达显著降低。1.5体外模拟病理条件处理足细胞检测UHRF1的表达变化分别用糖基化终末产物（advanced glycation and products,AGEs）、胆固醇（cholesterol）、棕榈酸（palmitic acid,PA）、氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein,ox-LDL）以及阿霉素刺激人来源的足细胞（human podocyte,HPC）,WB检测结果显示,在PA和ADR刺激下,足细胞UHRF1表达显著降低,并具有一定的剂量依赖性。第二部分:UHRF1在足细胞损伤中的作用及机制初探2.1足细胞UHRF1特异性敲除小鼠的构建采用Cre-LoxP重组系统构建足细胞特异性敲除UHRF1的小鼠,基因型鉴定结果显示:Pod-Cre/Uhrf1fl/fl（Cre+/-/Uhrf1fl/fl）小鼠即为目标小鼠。进一步对UHRF1与足细胞标记蛋白WT1免疫荧光双标,验证Cre+/-/Uhrf1fl/fl小鼠足细胞中UHRF1的敲除效率。免疫荧光实验发现足细胞UHRF1表达水平显著降低,以上结果证明足细胞UHRF1特异性敲除小鼠构建成功。2.2体内实验验证UHRF1在足细胞损伤中的功能与作用2.2.1分组与模型构建将8周Cre-/-/Uhrf1fl/fl作为对照鼠和Cre+/-/Uhrf1fl/fl鼠随机分组,分别构建STZ/HFD诱导的2型糖尿病肾病模型以及阿霉素诱导的局灶性节段性肾小球硬化模型。2.2.2 UHRF1缺失加重肾小球疾病模型中足细胞损伤检测指标:①蛋白尿,分析尿白蛋白/肌酐比（urinary albumin/creatinine ratio,UACR）;②过碘酸雪夫氏染色（periodic acid-schiff stain,PAS）,对糖原进行染色,观察肾小球形态变化;③透视电镜分析足细胞的数目,足突融合以及基底膜厚度;④免疫荧光染色检测肾病蛋白（Nephrin）,足突蛋白（Podocin）;⑤免疫荧光检测肾小球硬化指标,肌肉组织肿瘤表达的结蛋白（Desmin）。结果分析:①足细胞UHRF1的缺失会增加由STZ/HFD及ADR诱导的肾病小鼠UACR值;②PAS结果显示UHRF1的缺失导致STZ/HFD及ADR诱导的肾病小鼠肾小球阳性着色比例增加,系膜基质增生,系膜扩张加重;③透射电镜结果显示UHRF1的缺失加重STZ/HFD及ADR诱导的肾病小鼠肾小球足细胞损伤,加重足突的融合与基底膜增厚程度;④IF显示UHRF1的缺失加重STZ/HFD及ADR诱导的肾病小鼠足细胞功能蛋白Nephrin,Podocin的损伤;⑤Desmin荧光染色显示足细胞UHRF1的缺失会加重STZ/HFD及ADR诱导的肾病小鼠肾小球的硬化程度。以上结果表明UHRF1缺失加重肾小球疾病模型中足细胞损伤。2.3过表达UHRF1可显著改善PA引起的足细胞损伤利用腺病毒转染技术在人足细胞HPC中过表达UHRF1。检测指标:①WB验证UHRF1过表达效率;②采用PA（250 μmol/L）刺激足细胞24 h,WB检测功能蛋白Nephrin和Podocin蛋白表达;③流式细胞术（flow cytometry method,FCM）检测细胞凋亡;④F-肌动蛋白（F-actin）荧光染色共聚焦观察足细胞骨架重排。结果分析:①WB结果显示腺病毒过表达UHRF1,UHRF1的蛋白水平显著升高;②WB结果显示PA刺激引起足细胞Nephrin和Podocin蛋白表达水平下降,过表达UHRF1可部分恢复Nephrin和Podocin蛋白表达,提示UHRF1可减轻足细胞损伤;③FCM结果显示过表达UHRF1会减少PA导致的足细胞凋亡比例;④F-actin荧光染色结果显示过表达UHRF1可改善棕榈酸引起的细胞骨架坍塌和重排。以上结果表明过表达UHRF1能改善PA引起的足细胞损伤。2.4 UHRF1在足细胞损伤中的作用及机制初探2.4.1初步探索UHRF1在足细胞损伤相关肾小球疾病中蛋白表达下调的机制RT-qPCR检测db/db小鼠肾皮质及PA处理足细胞24小时后,UHRF1的mRNA水平,结果显示UHRF1 mRNA表达水平没有显著变化。而在体外实验中,PA刺激时,加入蛋白酶体抑制剂MG132,可部分恢复由PA引起的UHRF1表达降低。提示UHRF1在足细胞损伤相关肾小球疾病中,可能通过泛素-蛋白酶体途径降解,引起蛋白表达降低。2.4.2 UHRF1改善足细胞损伤的调控机制全基因组寡核苷酸测序分析HPC在PA刺激时UHRF1基因过表达组与对照组差异表达基因,以期找到UHRF1改善足细胞损伤的调控机制。结果显示,在PA刺激下泛素结合酶 E2 S（ubiquitin-conjugatingenzyme E2 S,UBE2S）的 mRNA 表达升高,过表达UHRF1可降低Ube2s的mRNA表达。体外WB实验结果显示,HPC在PA刺激下,UBE2S 及缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α）表达升高,过表达UHRF1可降低UBE2S及HIF-1α表达,提示UHRF1可能通过调控UBE2S-HIF-1α通路而改善足细胞损伤。结论与创新性1.UHRF1在高脂诱导的肾脏损伤模型、2型糖尿病肾病模型以及ADR诱导的FSGS模型中,在足细胞内表达均显著降低,提示UHRF1可能参与足细胞损伤相关肾小球疾病的病理生理调控过程。2.足细胞特异性敲除UHRF1加重STZ/HFD诱导的2型糖尿病肾病及阿霉素诱导的局灶性节段性肾小球硬化模型足细胞损伤。体外过表达UHRF1改善PA引起的足细胞损伤,进一步通过全基因组寡核苷酸测序分析及体外实验发现UHRF1可能通过抑制UBE2S-HIF-1α信号通路,减轻足细胞损伤。3.本研究丰富了 UHRF1的生物学功能认识,为足细胞损伤相关肾小球疾病的临床防治提供重要的理论基础与潜在靶点。