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背景及目的:原发性肝癌(Primary Hepatic Carcinoma,PLC,以下简称肝癌)是临床上最常见的恶性肿瘤之一,其恶性程度高,起病隐匿,病情进展快,而且容易复发转移,全球发病率逐年增长,发病率和死亡率非常高,对人类生命健康影响很大,具有一定的危害性,严重威胁人们的生命和健康。诱导肝癌发生的因素很多,有黄曲霉毒素摄入、病毒感染、基因遗传、吸烟、饮水及饮酒等,迄今为止,其诱发机制尚未完全明了。脂质是一类难溶于水而易溶于脂肪溶剂等非极性有机溶剂的化合物,其化学成分和结构上非均一,主要由碳、氢、氧三大元素以非极性的共价键组成,且在人体内数目繁多、分布广泛。越来越多的研究表明,脂质的合成及代谢紊乱与疾病密切相关,包括癌症。此外,脂质分子也亿被证实为肿瘤微环境中肿瘤细胞与基质之间交流的重要媒介。本文旨在通过液相色谱-电喷雾电离质谱-多反应监测技术联用(简称LC-ESI-MRM/MS),分析甘油磷脂和鞘脂两大类脂质分子在肝癌转移过程中的变化。此外,本研究进一步筛选出变化量较大的脂质分子,通过体外培养作用于不同转移潜能的肝癌细胞,观察脂质分子对肝癌细胞生物学行为的影响,为肝癌的早诊、治疗及预防寻求新的思路,并为改善患者预后提供理论依据。方法:本研究第一部分通过液相色谱-电喷雾电离质谱-多反应监测技术联用,对经M2肿瘤相关巨噬细胞条件培养(M2CM)处理后肝癌细胞的甘油磷脂和鞘脂两大类脂质分子进行定量分析,希望能明确M2CM促进肝癌转移过程中导致的肝癌细胞脂质变化。第二部分利用CCK-8法检测细胞活力来验证细胞的增殖能力,筛选出适当的脂质分子浓度,再采用此浓度的脂质分子作用于不同转移潜能的MHCC-97L和MHCC-97H肝癌细胞,利用细胞划痕实验和Transwell法细胞侵袭实验来评估肝癌细胞的迁移和侵袭能力,最后通过细胞周期实验检测不同转移潜能肝癌细胞的细胞周期情况。采用SPSS16.0统计学软件进行统计分析,P<0.05被认为具有统计学差异。结果:1.通过LC-ESI-MRM/MS技术,对经M2CM刺激48小时的肝癌细胞的甘油磷脂及鞘脂类脂质变化进行定量分析。正离子扫描模式下,经M2CM处理后的MHCC-97H与对照组比,其lysoPC及PC含量均显著上升(Fold Change分别为2.45和1.71),而Cer及具有d类结构的鞘脂含量则显著下降(Fold Change分别为0.26和0.45);负离子扫描模式下,C1P在M2CM处理后的MHCC-97H中明显升高(Fold Change=0.35)。进一步对经M2CM处理后肝癌细胞及对照组中检测的所有脂质分子进行相对定量分析,按照处理组与对照组脂质分子进行比较时,信号强度变化倍数>1.5或<0.67且P<0.05的标准,我们在经M2CM处理后的MHCC-97H中发现了77个差异脂质分子,其中49个显著升高,28个显著降低,上调的脂质主要为lysoPC、PC及部分长链PE,而主要下调者为短链PE及PS。2.在MHCC-97L和MHCC-97H肝癌细胞中,CCK-8法检测细胞增殖能力实验发现,50μmol/L 的 LysoPC14:0 可增强 MHCC-97L 和 MHCC-97H两种细胞的细胞活力,随着干预时间的延长,较其他浓度的LysoPC14:0,其促进作用趋于稳定。细胞划痕实验观察在划痕后12h、24h两个时间点细胞的迁移情况并计算迁移率,结果显示:在MHCC-97L肝癌细胞中,实验组在12h和24h时间点的迁移率的平均值分别为0.34±0.01和0.54±0.02;对于MHCC-97H肝癌细胞,实验组在12h和24h时间点的迁移率的平均值分别为0.34±0.04和0.56±0.04。在两种细胞中,LysoPC14:0脂质组细胞迁移率均高于对照组(P<0.05)。Transwell实验表明,LysoPC14:0脂质组的侵袭能力比对照组要强(P<0.05)。流式细胞周期实验发现,在MHCC-97L细胞中,对照组和实验组的各期之间无显著统计学差异(P>0.05);在MHCC-97H细胞中,较对照组,LysoPC14:0组细胞G1期比率较高(P<0.05),S期细胞数明显降低(P<0.05),G2/M期中细胞数减少。这表明在不同转移潜能的肝癌细胞中,LysoPC14:0对细胞周期影响的具体机制可能存在一定的差异。结论:1.M2CM刺激能显著影响肝癌细胞的脂质组成,其促进肝癌迁移及侵袭的作用可能是通过改变肝癌细胞的脂质成分进行的;2.一定浓度的LysoPC14:0对肝癌细胞的细胞增殖能力、细胞迁移及侵袭能力均有促进作用,表明脂质分子参与到肝癌细胞的生长发展以及转移侵袭等各个环节中,为肝癌的发生发展提供了理论依据。