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十二指肠贾第虫（Giardia duodenalis）,又称蓝氏贾第虫（Giardia lamblia）或肠道贾第虫（Giardia intestinalis）,简称贾第虫（Giardia）,是一种重要的人兽共患原虫,主要寄生于十二指肠,引起贾第虫病（Giardiasis）。贾第虫病的临床表现主要是水样腹泻、脂肪泻、腹痛、呕吐、营养吸收不良和体重减轻。贾第虫还是免疫力低下患者如艾滋病患者、器官移植患者、癌症患者等人群的致死性因素。目前临床上治疗贾第虫病的药物使用最多的是甲硝唑,但存在副作用和耐药性的问题,而且目前尚无有效疫苗预防贾第虫病。究其原因是对贾第虫的致病机制尚不明确,寻找关键的分子靶标尤为重要。Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）,是哺乳动物先天免疫系统中重要模式识别受体（PRRs）,在抗寄生虫感染和致病中发挥关键作用。TLRs可识别多种寄生虫,如先前研究的利什曼原虫、疟原虫、阴道毛滴虫以及贾第虫等。实验室前期证明了贾第虫无病毒株可上调小鼠巨噬细胞TLR2、TLR4和TLR9的表达,贾第虫携病毒株除了上调TLR2、TLR4和TLR9的表达,还可引发TLR3表达的增加。其中,TLR2、TLR3和TLR4已有报道揭示相关具体的分子机制。然而目前为止,TLR9在贾第虫感染过程中发挥的作用还未见报道。本研究通过探索TLR9在无病毒株和携病毒株贾第虫感染过程中的作用及分子识别机制,以期为贾第虫病的防治提供理论基础和新的靶标。主要研究如下:1.宿主TLR9在贾第虫感染过程中的作用1.1无病毒株和携病毒株贾第虫刺激触发小鼠腹腔巨噬细胞中TLR9的激活分离小鼠腹腔巨噬细胞,同时体外纯培养贾第虫滋养体,建立贾第虫刺激细胞模型,通过荧光定量PCR检测TLR9 m RNA表达水平。结果表明,贾第虫刺激可引起小鼠腹腔巨噬细胞TLR9 m RNA表达水平显著上调,且无病毒株和携病毒株贾第虫刺激组TLR9 m RNA表达水平在统计学上无显著差异。1.2无病毒株和携病毒株贾第虫通过TLR9介导小鼠腹腔巨噬细胞产生促炎细胞因子通过si RNA转染干扰小鼠腹腔巨噬细胞TLR9的表达,用无病毒株和携病毒株贾第虫分别刺激巨噬细胞,应用Western blot和ELISA分别检测TLR9蛋白的表达及促炎细胞因子的产生。结果表明,TLR9 si RNA处理后极显著降低了贾第虫诱导的小鼠腹腔巨噬细胞TLR9的表达水平,贾第虫诱导的促炎细胞因子IL-6、TNF-α和IL-12 p40的分泌水平也极显著下降,且贾第虫携病毒株引发促炎细胞因子的分泌水平极显著高于无病毒株。2.TLR9及其相关炎症信号通路在贾第虫感染中的作用2.1贾第虫触发p38/ERK MAPKs、AKT和NF-κB p65信号通路的激活建立贾第虫刺激细胞模型,通过Western blot和ELISA的方法分别检测贾第虫对巨噬细胞信号通路的激活及促炎细胞因子的分泌。结果证明,贾第虫能够引起p38、ERK、AKT、p65和IκBα的磷酸化,引发巨噬细胞促炎细胞因子IL-6、TNF-α和IL-12 p40水平的逐渐升高。2.2无病毒株和携病毒株贾第虫通过TLR9介导p38/ERK MAPKs、AKT信号通路的激活分别用无病毒株和携病毒株贾第虫刺激TLR9 si RNA处理的小鼠巨噬细胞,应用Western blot和ELISA分别检测TLR9 si RNA处理后信号通路的激活及促炎细胞因子的分泌,免疫荧光试验观察巨噬细胞中p65定位。结果发现,TLR9 si RNA处理极显著降低了无病毒株和携病毒株贾第虫诱导的p38/ERK MAPKs和AKT磷酸化水平,而p65和IκBα的磷酸化水平均无显著变化。在WT和TLR9 si RNA处理的小鼠腹腔巨噬细胞中均能观察到无病毒株和携病毒株贾第虫诱导p65入核的现象。2.3无病毒株和携病毒株贾第虫通过TLR9介导的p38/ERK MAPKs和AKT通路调控宿主细胞的炎性应答首先分别使用p38、ERK和AKT抑制剂SB203580、PD98059和MK-2206 2HCl预处理小鼠腹腔巨噬细胞,然后分别用无病毒株和携病毒株贾第虫同时刺激巨噬细胞,通过Western blot检测p38、ERK和AKT的磷酸化及ELISA检测促炎细胞因子的分泌。结果发现,p38、ERK和AKT抑制剂均分别极显著降低无病毒株和携病毒株贾第虫诱导的p38、ERK和AKT的磷酸化水平,p38和ERK抑制剂均显著降低促炎细胞因子IL-6、TNF-α和IL-12 p40的分泌水平,而AKT抑制剂显著提高了促炎细胞因子的分泌水平。3.TLR9在贾第虫诱导小鼠巨噬细胞焦亡中的作用3.1贾第虫激活GSDMD介导的小鼠巨噬细胞焦亡通过LPS预处理小鼠腹腔巨噬细胞,应用Western blot、ELISA和LDH试验分别检测巨噬细胞细胞焦亡关键蛋白的表达或活化、IL-1β分泌和LDH释放情况。结果显示,贾第虫刺激小鼠腹腔巨噬细胞后,可引起NLRP3和IL-1β表达、IL-1β分泌水平和LDH释放量增加以及GSDMD蛋白的N端释放。3.2无病毒株和携病毒株贾第虫不依赖于TLR9激活小鼠巨噬细胞焦亡分别用无病毒株和携病毒株贾第虫刺激TLR9 si RNA处理的小鼠巨噬细胞,应用Western blot、ELISA和LDH试验分别检测巨噬细胞细胞焦亡关键蛋白的表达或活化水平、IL-1β分泌水平和LDH释放量。结果显示,TLR9 si RNA处理组中无病毒株和携病毒株贾第虫诱导的NLRP3和IL-1β表达水平、IL-1β分泌水平、GSDMD的N端释放量以及LDH释放量与阴性对照组相似。综上所述,无病毒株和有病毒株贾第虫均可激活小鼠腹腔巨噬细胞TLR9,小鼠巨噬细胞通过TLR9-p38/ERK信号通路产生促炎细胞因子杀伤贾第虫,同时贾第虫通过TLR9-AKT信号通路减弱宿主的免疫反应。此外,无病毒株和有病毒株贾第虫以不依赖于TLR9的方式活化NF-κB p65信号通路,促进NLRP3表达和活化,通过GSDMD介导的细胞焦亡加强炎症反应以控制贾第虫感染。本研究表明TLR9介导的先天免疫通路可成为防治贾第虫病的潜在的分子靶标。