早在1971年,Folkman就提出了肿瘤生长具有血管生成依赖性这一概念,以后陆续有实验研究表明,肿瘤连续性生长必需有血管形成,当实体瘤生长到直径为2mm时,如继续生长,就需要血管供应的保障,瘤细胞可能产生一种肿瘤血管生长因子促进血管内皮细胞的分裂,出现新的毛细血管,进而沟通血流,进入肿瘤组织内,保证瘤组织的氧和营养,同时,新生血管为肿瘤代谢产物的排除提供了途径,因此,血管生成是肿瘤侵袭性生长、转移的基础。抗肿瘤的血管形成治疗,尤其是抗肿瘤的血管形成基因疗法、寻找最佳抗肿瘤血管形成的靶位成了当今肿瘤治疗研究的一个热点。血管内皮细胞在肿瘤血管生成中起着极为重要的作用。机体的血管形成有两种方式:血管发生和血管生成。血管发生是胚胎发育过程中成血管细胞发展、形成原始血管的过程,包括内皮细胞分化、增殖、迁移、连接并形成原始血管丛等。血管生成是原始血管丛或已存在的血管经发芽或其他方式形成新血管的过程,包括内皮细胞降解细胞外基质,并通过趋化移动、增殖,形成新管腔等过程。因此,以血管内皮细胞为靶点的抗血管新生治疗已成为肿瘤治疗的研究热点。针对肿瘤血管内皮细胞抗肿瘤血管生成有以下优势:①血管内皮细胞基因组较为稳定,针对血管内皮细胞治疗不易获得耐药;②正常成熟组织毛细血管内皮细胞处于静止状态,而肿瘤血管内皮细胞增殖活跃,出现许多相对特异标记分子,如整合素aVB3、E-选择素、VEGF受体及Tie,它们的表达较正常静止内皮细胞高50倍以上,是抗肿瘤血管生成的分子。③从理论上推算一个内皮细胞要饲养50-100个肿瘤细胞,针对血管内皮细胞比直接针对肿瘤细胞治疗更为有效。④肿瘤生成血管依赖性是所有肿瘤共有的,理论上适合各种肿瘤。人脐静脉内皮细胞具有分化潜能和新生血管内皮细胞的特性,且它对包括炎症因子在内的多种体内因子均有很好的反应性,与动物血管内皮细胞相比,可使实验条件和所获得结果更符合人体情况。因而,人脐静脉内皮细胞是研究肿瘤血管内皮细胞理想细胞模型。Tie2是近年来新发现的除血管内皮细胞生长因子(VEGF)之外的另一参与血管生成调控的主要基因,其是几乎完全由血管内皮细胞表达的酪氨酸激酶受体,对血管内皮细胞的增殖、水解基底膜、迁移和血管构建的调控作用较强且特异性高。有研究报道缺乏Tie2基因的小鼠往往死于胚胎期的血管发育障碍,提示Tie2在血管生成中起重要的调节作用。研究表明,部分对阻断VEGF途径无生物反应的肿瘤常表达Tie2,而单独阻断Tie2途径可抑制这一部分的肿瘤生长,提示Tie2和VEGF信号通路是调控肿瘤生长的两条独立的途径。RNA干扰是特异性基因表达沉默的强有力手段之一,其广泛存在真核生物中,是生物体在进化上的一种保守的基因组水平的免疫监控机制。具有高度特异性、高效率、放大效应并可遗传的特点。作为一种新的反向遗传学研究基因功能的方法克服了正向遗传学中预测性基因功能分析的存在假阳性结论的缺点,这种高通量的基因沉默技术能够抑制生物体基因组内每一条基因的表达,从整体系统地研究基因的功能及不同基因间的关系。为了进一步探讨Tie2基因对人脐静脉内皮细胞增殖活性的影响,为后期进行体内抑制肿瘤血管生成的动物实验研究奠定基础,为肿瘤的基因治疗提供实验依据,本实验采用RNA干扰技术,通过阳离子脂质体LIPOFECTAMINE2000介导,将含有针对Tie2的特异性shRNA转染人脐静脉内皮细胞HUVECs中。采用实时定量RT-PCR、免疫细胞化学染色及Western blot检测各组HUVECs中Tie2的mRNA及蛋白表达的改变情况,MTT法检测HUVECs的生长曲线变化,并在显微镜下观察细胞凋亡情况。研究内容共分为四章:第一章人脐静脉内皮细胞的分离纯化及鉴定;第二章Tie2在HUVECs中的表达及意义;第三章pGenesil 1.1-U6-Tie2-shRNA重组质粒的构建及鉴定;第四章pGenesil 1.1-Tie2-shRNA重组质粒干扰HUVECs中Tie2表达及其对HUVECs增殖的影响。第一章人脐静脉内皮细胞的分离纯化及鉴定1.目的:体外分离培养HUVECs,并鉴定所培养的细胞为血管内皮细胞。2.方法:从中山医科大学第一附属医院妇产科获取健康新鲜足月剖宫产胎儿脐带,以酶消化法获得HUVECs并进行培养,制备细胞爬片,同时设置阴性对照,经免疫细胞荧光技术鉴定,根据参考相关文献制定判定标准,证明所培养细胞为血管内皮细胞。3.结果以酶消化法可获得以HUVECs为主的混合细胞悬液,经反复贴壁法分离纯化内皮细胞,Ⅷ因子免疫荧光化学法显示分离纯化所获得的HUVECs 95%以上的细胞胞浆内有荧光表达,证实了所纯化的细胞为血管内皮细胞。第二章Tie2在HUVECs中的表达及意义1.目的:检测HUVECs中Tie2 mRNA水平及蛋白表达水平。旨在探讨Tie2在体外血管生成中的作用。2.方法:收集生长良好的细胞,计数,按Trizol试剂盒说明抽提总RNA,Tie2mRNA的表达按照RT-PCR试剂盒说明书进行。免疫细胞化学染色检测HUVECs中Tie2蛋白的表达水平:以Tie2兔抗人多克隆抗体为一抗,按SABC免疫组化试剂盒说明进行,DAB显色。每批次均以PBS代替一抗作阴性对照片一张,以已知Tie2高表达的人脐静脉内皮细胞株ECV304和博士德公司提供的Tie2阳性片作阳性对照。结果按照Birner等报道的方法进行判定。3.结果:Tie2基因在体外培养的HUVECs中呈高水平表达。第三章pGenesil 1.1-U6-Tie2-shRNA重组质粒的构建及鉴定1.目的:构建pGenesil 1.1-U6-Tie2-shRNA重组质粒。2.方法:在NCBI数据库中查找Tie2的mRNA全序列,根据shRNA设计原则,设计能编码Tie2-shRNA的寡核苷酸链,交武汉晶赛公司合成。根据pGenesil1.1-U6-shRNA质粒的结构图,将pGenesil 1.1用Eco31Ⅰ酶切使其线性化;将稀释退火片段与线性化pGenesil-1.1质粒表达载体的连接构建pGenesil1.1.U6-Tie2-shRNA重组质粒;重组质粒经酶切鉴定并测序证实与设计一致。3.结果:成功构建pGenesil 1.1-U6-Tie2-shRNA重组质粒,经酶切及测序鉴定证实所构建的质粒与设计的完全相符。第四章pGenesil 1.1-Tie2-shRNA重组质粒干扰HUVECs中Tie2表达及其对HUVECs增殖的影响1.目的:探讨应用RNA干扰(RNAi)技术沉默Tie2基因,观察其对人脐静脉内皮细胞HUVECs增殖活性的影响,为将来进一步进行抑制肿瘤血管生成的动物实验研究奠定基础,为肿瘤的基因治疗提供实验依据。2.方法:pGenesil 1.1-U6-Tie2-shRNA重组质粒通过LIPOFECTAMINE 2000脂质体、介导转染HUVECs,同时设计阴性对照和空白对照。采用实时定量RT-PCR、免疫细胞化学染色及Western blot检测各组HUVECs中Tie2mRNA及蛋白表达的改变情况,MTT法(噻唑蓝比色分析法)检测HUVECs的生长曲线变化,显微镜下观察细胞凋亡情况并计算凋亡细胞数。3.结果:pGenesil 1.1-U6-Tie2-shRNA重组质粒转染HUVECs后,实验组细胞中Tie2mRNA表达低于两对照组,而且实验组转染后48h的Tie2mRNA表达量较24h降低;Tie2蛋白表达明显低于阴性对照和空白对照组(P＜0.05),且实验组转染后48h的Tie2蛋白表达量显著低于实验组转染后24h(P＜0.05);而凋亡率显著高于两对照组(P＜0.05);生长曲线显示实验组细胞增殖活性较两对照组受到明显抑制(P＜0.05)。全文结论:(1)胰蛋白酶灌流消化法可获得大量高纯度的人脐静脉内皮细胞。第Ⅷ因子相关抗原检测证实了所分离获得的细胞为血管内皮细胞。(2)Tie2在HUVECs中呈高水平表达。(3)成功构建pGenesil 1.1-U6-Tie2-shRNA重组质粒。(4)pGenesil 1.1-U6-Tie2-shRNA重组质粒在体外能够抑制HUVECs的Tie2的mRNA和蛋白表达,转染后的HUVECs凋亡率明显比对照组高,其增殖活性受到明显抑制。本研究为靶向肿瘤血管内皮细胞Tie2基因抑制肿瘤血管生长奠定了实验基础。