目的:HNP1是迄今发现含量最多、活性最强的杀菌分子,其抗感染以及对恶性增生细胞的杀伤作用既是其应用价值所在,同时是基因工程中宿主不能有效表达HNP1的根本原因。本课题旨在通过构建pET-28a(+)-preproHNP1、pET-28a(+)-proHNP1和pGEX-4T-3-preproHNP1来探究真核基因HNP1在原核体系的表达过程,以期寻找相关的激活机制和影响因素,为获得高效表达HNP1前体蛋白的基因工程菌株奠定实验基础。方法:定点诱变和基因工程技术构建pET-28a(+)-preproHNP1、pET-28a(+)-proHNP1和pGEX-4T-3-preproHNP1原核表达载体;考马斯亮蓝染色及Western-Blot检测比较preproHNP1和proHNP1蛋白在原核体系中的表达效率;镍离子金属鳌合亲和层析纯化preproHNP1蛋白;检测preproHNP1蛋白的抑菌活性;检测IPTG诱导preproHNP1和proHNP1表达后细菌的生长状况;质谱鉴定前体及成熟HNP1蛋白在原核体系的表达;糖蛋白染色检测HNP1的糖基化修饰;Red同源重组技术构建基因敲除体系。结果:pET-28a(+)-preproHNP1、pET-28a(+)-proHNP1及pGEX-4T-3-preproHNP1重组质粒构建成功;在BL21(DE3)原核体系中,pET-28a(+)-preproHNP1的表达效率比pET-28a(+)-proHNP1更高;纯化的preproHNP1蛋白无明显抑菌效果;IPTG诱导preproHNP1和proHNP1后细菌生长均受到了抑制,但抑制效果无明显差异;质谱检测到原核表达体系能够合成前体和成熟HNP1;IPTG诱导后在原核表达体系中检测到了 HNP1的糖基化修饰;Red敲除体系构建成功。结论:大肠杆菌中可能也存在与人体相似的HNP1激活机制,即前体蛋白具有一定的杀菌能力是假象,而是通过激活的成熟HNP1起作用;19个氨基酸残基的信号序列对包涵体蛋白的形成无影响;糖基化与信号序列无关,但可能与HNP1激活有关。