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【目的】
1.探讨miR-181d和Dock4在脑缺血再灌注(I / R)损伤大鼠模型中的表达变化；
2.探讨miR-181d和Dock4在氧糖剥夺/复氧(OGD / R)损伤的小鼠神经瘤(Neuro-2a)细胞模型中的表达水平变化及二者的调控关系；
3.初步探讨miR-181d靶向调节Dock4在OGD/R致Neuro-2a细胞缺血性损伤中的作用机制。
【方法】
1.采用线栓法构建大鼠脑缺血再灌注(Cerebral Ischemia / Reperfusion, I / R)动物模型，采用实时定量PCR(RT-qPCR)和蛋白质免疫印记(Western blot)分别检测缺血脑组织中miR-181d和Dock4的表达；
2.构建Neuro-2a细胞的氧糖剥夺/复氧(Oxygen-glucose deprivation /Reperfusion，OGD / R)细胞模型，分别于复氧3h、6h、12h和24h检测Neuro-2a细胞中miR-181d和Dock4的表达水平。
3.通过CCK-8、LDH、ROS、AnnexinV-FITC/PI双染色、Westernblot等实验研究过表达miR-181d对Neuro-2a细胞增殖、细胞毒性、氧化应激和细胞凋亡的影响。
4.Targetscan软件预测miR-181d和Dock4的靶向关系，通过双荧光素酶报告基因方法以及Westernblot验证miR-181d对Dock4的调控作用。
5.在Neuro-2a细胞中上调miR-181d的同时过表达Dock4，通过CCK-8，LDH，ROS，AnnexinV-FITC/PI双染色法和Westernblot检测外源性过表达Dock4对细胞增殖、细胞毒性、氧化应激以及细胞凋亡的影响。
【结果】
1.I/R模型大鼠脑梗死皮层中miR-181d的表达水平高于对照组(P＜0.05)，Dock4mRNA和蛋白表达水平均明显低于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
2.在Neuro-2a细胞OGD/R模型中，氧糖剥夺4h后随着复氧时间延长，miR-181d表达水平逐渐上升(P＜0.05)，至12h达到峰值，相应地，Dock4mRNA和蛋白表达水平均下降，至12h降到最低，其表达水平与miR-181d的表达呈负相关(P＜0.05)。
3.miR-181d过表达可减缓OGD/R诱导的Neuro-2a细胞增殖、增加细胞毒性、加剧氧化应激、促进细胞凋亡，增加促凋亡蛋白Bax及Caspase-3的表达，减少抗凋亡蛋白Bcl-2的表达(P＜0.05)。相反地，抑制miR-181d表达能促进细胞增殖、降低细胞毒性、减轻氧化应激、减少细胞凋亡，增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，减少促凋亡蛋白Bax及Caspase-3的表达(P＜0.05)。
4.双荧光素酶报告基因检测及Westernblot结果表明miR-181d直接靶向Dock4并抑制其表达。
5.外源性过表达Dock4可改善miR-181d调控的Neuro-2a细胞增殖，并减轻细胞毒性、氧化应激及凋亡(P＜0.05)。
【结论】
1.miR-181d在大鼠脑缺血再灌注(I / R)大鼠模型及OGD/R细胞模型中表达均上调。
2.miR-181d可以加重OGD/R处理对Neuro-2a细胞的损伤，减缓细胞增殖、增加细胞毒性、加剧氧化应激、促进细胞凋亡；
3.miR-181d可通过靶向调节Dock4在OGD/R致Neuro-2a细胞缺血性损伤中发挥抑制性作用。
1.探讨miR-181d和Dock4在脑缺血再灌注(I / R)损伤大鼠模型中的表达变化；
2.探讨miR-181d和Dock4在氧糖剥夺/复氧(OGD / R)损伤的小鼠神经瘤(Neuro-2a)细胞模型中的表达水平变化及二者的调控关系；
3.初步探讨miR-181d靶向调节Dock4在OGD/R致Neuro-2a细胞缺血性损伤中的作用机制。
【方法】
1.采用线栓法构建大鼠脑缺血再灌注(Cerebral Ischemia / Reperfusion, I / R)动物模型，采用实时定量PCR(RT-qPCR)和蛋白质免疫印记(Western blot)分别检测缺血脑组织中miR-181d和Dock4的表达；
2.构建Neuro-2a细胞的氧糖剥夺/复氧(Oxygen-glucose deprivation /Reperfusion，OGD / R)细胞模型，分别于复氧3h、6h、12h和24h检测Neuro-2a细胞中miR-181d和Dock4的表达水平。
3.通过CCK-8、LDH、ROS、AnnexinV-FITC/PI双染色、Westernblot等实验研究过表达miR-181d对Neuro-2a细胞增殖、细胞毒性、氧化应激和细胞凋亡的影响。
4.Targetscan软件预测miR-181d和Dock4的靶向关系，通过双荧光素酶报告基因方法以及Westernblot验证miR-181d对Dock4的调控作用。
5.在Neuro-2a细胞中上调miR-181d的同时过表达Dock4，通过CCK-8，LDH，ROS，AnnexinV-FITC/PI双染色法和Westernblot检测外源性过表达Dock4对细胞增殖、细胞毒性、氧化应激以及细胞凋亡的影响。
【结果】
1.I/R模型大鼠脑梗死皮层中miR-181d的表达水平高于对照组(P＜0.05)，Dock4mRNA和蛋白表达水平均明显低于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
2.在Neuro-2a细胞OGD/R模型中，氧糖剥夺4h后随着复氧时间延长，miR-181d表达水平逐渐上升(P＜0.05)，至12h达到峰值，相应地，Dock4mRNA和蛋白表达水平均下降，至12h降到最低，其表达水平与miR-181d的表达呈负相关(P＜0.05)。
3.miR-181d过表达可减缓OGD/R诱导的Neuro-2a细胞增殖、增加细胞毒性、加剧氧化应激、促进细胞凋亡，增加促凋亡蛋白Bax及Caspase-3的表达，减少抗凋亡蛋白Bcl-2的表达(P＜0.05)。相反地，抑制miR-181d表达能促进细胞增殖、降低细胞毒性、减轻氧化应激、减少细胞凋亡，增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，减少促凋亡蛋白Bax及Caspase-3的表达(P＜0.05)。
4.双荧光素酶报告基因检测及Westernblot结果表明miR-181d直接靶向Dock4并抑制其表达。
5.外源性过表达Dock4可改善miR-181d调控的Neuro-2a细胞增殖，并减轻细胞毒性、氧化应激及凋亡(P＜0.05)。
【结论】
1.miR-181d在大鼠脑缺血再灌注(I / R)大鼠模型及OGD/R细胞模型中表达均上调。
2.miR-181d可以加重OGD/R处理对Neuro-2a细胞的损伤，减缓细胞增殖、增加细胞毒性、加剧氧化应激、促进细胞凋亡；
3.miR-181d可通过靶向调节Dock4在OGD/R致Neuro-2a细胞缺血性损伤中发挥抑制性作用。