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背景:糖尿病是临床上最常见的疾病之一,糖尿病神经痛(diabetic neuropathicpain DNP)是由长期高血糖导致的慢性神经损伤所导致的慢性疼痛,以难治性疼痛和进行性感觉丧失为特征,是糖尿病的常见并发症之一。临床上治疗起来非常棘手。研究表明,糖尿病患者体内普遍存在低水平的非感染性炎性反应,这种炎性反应即使在血糖被纠正后依然存在,全身性的慢性炎性反应参与了糖尿病周围神经病变的形成,而NF-κB的激活是高血糖诱发炎性反应的关键靶点。NF-κB激活后,通过与目标DNA结合,促进TNF-α,IL-1,IL-6等炎性因子的释放,促使iNOS,COX2产生,诱发广泛的炎性反应,但是糖尿病导致NF-κB激活的上下游通路,目前并不十分清楚。最近的研究表明,脊髓Toll样受体4(TLR4)激活导致的神经炎性反应参与了DNP的发生,但具体机制不清。糖尿病神经痛大鼠脊髓背角NF-κB激活是否参与了神经痛的形成和维持,TLR4是否是NF-κB激活的上游通路,还需要进一步研究。在神经损伤或化疗引导致的神经病理性痛模型中,脊髓TLR4/MyD88/NF-κB信号通路激活与神经病理性痛的形成和维持有关。我们前期研究也表明,在紫杉醇导致的神经性病理性疼痛大鼠模型中,GABAB受体的下调发挥了重要作用,激活GABAB受体能够抑制NF-κB(TLR4的下游信号因子)的激活。上述研究提示,大鼠糖尿病神经痛的形成和维持可能与脊髓背角TLR4/MyD88/NF-κB信号通路过度激活,GABAB受体功能下降有关,GABAB受体可能与脊髓背角TLR4/MyD88/NF-κB信号通路间存在相互作用。
第一部分GABAB1,TLR2/4及其下游信号因子在糖尿病神经痛大鼠脊髓背角的表达
目的:探讨糖尿病神经痛大鼠脊髓背角GABAB1受体,TLR2/TLR4,以及下游信号因子MyD88,TRIF,NF-κBp65,炎性因子TNF-α和IL-1的表达变化,阐明糖尿病神经痛大鼠脊髓背角炎性反应增多的原因,并观察炎性反应对脊髓细胞凋亡的影响。
方法:腹腔注射链脲佐菌素(Streptozocin STZ)法制作糖尿病神经痛大鼠模型,采用实时定量PCR(RT-PCR),WesternBlot技术检测糖尿病神经痛大鼠脊髓背角GABAB1,TLR2,TLR4,MyD88,TRIF,和NF-κBp65mRNA和蛋白表达的变化,采用免疫荧光法技术检测脊髓背角TLR2,TLR4,MyD88,TRIF,和NF-κBp65阳性细胞率,采用ELISA的方法检测脊髓背角中TNF-α和IL-1的表达变化,采用TUNEL法检测脊髓背角细胞凋亡情况。
结果:与对照组比较,糖尿病神经痛(DNP)大鼠脊髓背角TLR4(P<0.01,P<0.05),MyD88(P<0.05)和NF-κBp65(P<0.05,P<0.01)mRNA和蛋白表达增多,GABAB1(P<0.05)的mRNA和蛋白表达下调,TLR4(P<0.01),MyD88(P<0.01)和NF-κBp65(P<0.01)阳性细胞率增高,TLR2和TRIF没有明显差异;DNP大鼠脊髓背角炎性因子TNF-α(P<0.001)和IL-1(P<0.001)表达增多;与对照组相比,DNP大鼠脊髓背角凋亡增多(P<0.01),凋亡细胞以神经元为主,也有部分胶质细胞(n=5)。
结论:糖尿病神经痛大鼠脊髓背角TLR4/MyD88/NF-κB信号通路显著激活,而GABAB1受体表达明显下调,脊髓背角TLR2以及TRIF可能未参与糖尿病神经痛的形成。糖尿病神经痛大鼠脊髓背角炎性因子TNF-α和IL-1表达增多,神经炎症增加,并且脊髓背角细胞凋亡增多,凋亡细胞以神经元为主,也有少部分胶质细胞。
第二部分抑制脊髓TLR4/MyD88/NF-κB信号通路对大鼠糖尿病神经痛的影响及作用机制
目的:从不同位点抑制糖尿病神经痛大鼠脊髓TLR4/MyD88/NF-κB信号通路,观察对脊髓背角内该信号通路下游信号因子表达,炎性反应和细胞凋亡的影响,以及对大鼠机械缩足阈值和热缩足潜伏期的影响,阐明脊髓背角TLR4/MyD88/NF-κB信号通路在大鼠糖尿病神经痛形成和维持中的作用。
方法:采用糖尿病神经痛大鼠模型,大鼠行鞘内置管,鞘内分别给予TLR4,MyD88和NF-κB的抑制剂,探讨从不同位点抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路对糖尿病神经痛大鼠机械缩足阈值和热缩足潜伏期的影响,并取脊髓背角,采用WesternBlot技术探讨对MyD88和NF-κBp65蛋白表达的影响,采用ELISA技术探讨对炎性因子TNF-α和IL-1表达的影响,采用TUNEL法检测对脊髓背角细胞凋亡的影响。
结果:与DNP组比较,DNP+LPS-RSultrapure(选择性TLR4拮抗剂)组和DNP+MIP(MyD88拮抗剂)组大鼠在鞘内给药后第1,2,3天,DNP+SN50(NF-κB抑制剂)组大鼠在鞘内给药后第2,3天机械缩足阈值和热缩足潜伏期明显增加(P<0.05,n=12);与DNP组比较,DNP+LPS-RS组大鼠脊髓背角MyD88(P<0.01)和NF-κBp65(P<0.01)表达降低,TNF-α(P<0.001)和IL-1(P<0.001)表达减少,细胞凋亡率降低(P<0.01)((n=4);DNP+MIP组大鼠脊髓背角NF-κBp65表达降低(P<0.01),TNF-α(P<0.001)和IL-1(P<0.001)表达减少,细胞凋亡率降低(P<0.01)((n=4);DNP+SN50组大鼠大鼠脊髓背角TNF-α和IL-1表达减少(P<0.001),细胞凋亡率降低(P<0.01)((n=6)。
结论:大鼠糖尿病神经痛的形成和维持与脊髓背角TLR4/MyD88/NF-κB信号通路激活有关,从不同位点抑制该信号通路均可减轻糖尿病神经痛,并下调下游信号因子的表达。抑制糖尿病神经痛大鼠脊髓TLR4/MyD88/NF-κB信号通路可通过减少TNF-α和IL-1等细胞因子的表达减轻脊髓背角细胞凋亡。
第三部分激活GABAB受体通过抑制脊髓TLR4/MyD88/NF-κB信号通路减轻糖尿病神经痛
目的:探讨激活GABAB受体对糖尿病神经痛大鼠脊髓背角TLR4/MyD88/NF-κB信号通路以及下游炎性反应和细胞凋亡的影响,进一步阐明激活GABAB受体治疗糖尿病神经痛的作用机制。
方法:采用腹腔注射STZ的方法制作糖尿病神经痛大鼠模型并行鞘内置管,鞘内分别给予GABAB受体激动剂和阻断剂,观察其对糖尿病神经痛大鼠机械缩足阈值和热缩足潜伏期的影响,并取脊髓背角,采用WesternBlot技术和免疫荧光技术探讨其对TLR4,MyD88和NF-κBp65表达的影响,采用ELISA技术检测对下游炎性因子TNF-α和IL-1表达的影响,采用TUNEL法检测对脊髓背角细胞凋亡的影响。
结果:与DNP组比较,DNP+Baclofen(GABAB受体激动剂)组大鼠在鞘内给药后第1,2,3天机械缩足阈值和热缩足潜伏期明显增加(P<0.05,n=16),脊髓背角TLR4(P<0.01,P<0.05),MyD88(P<0.05)和NF-κBp65(P<0.05,P<0.01)蛋白表达和阳性细胞率降低,TNF-α(P<0.001)和IL-1(P<0.001)表达减少,细胞凋亡率降低(P<0.05)(n=4);DNP+Saclofen(GABAB受体阻断剂)组大鼠在给药后第2,3天机械缩足阈值和热缩足潜伏期明显降低(P<0.05,n=16),脊髓背角TLR4(P<0.05),MyD88(P<0.05)和NF-κBp65(P<0.05,P<0.01))蛋白表达和阳性细胞率增高,TNF-α(P<0.001)和IL-1(P<0.001)表达增加(n=4)。
结论:激活GABAB受体能够减轻大鼠糖尿病神经痛,其机制与抑制脊髓背角TLR4/MyD88/NF-κB信号通路,下调下游炎性因子TNF-α和IL-1的表达,减轻神经炎症,减少细胞凋亡有关。
第一部分GABAB1,TLR2/4及其下游信号因子在糖尿病神经痛大鼠脊髓背角的表达
目的:探讨糖尿病神经痛大鼠脊髓背角GABAB1受体,TLR2/TLR4,以及下游信号因子MyD88,TRIF,NF-κBp65,炎性因子TNF-α和IL-1的表达变化,阐明糖尿病神经痛大鼠脊髓背角炎性反应增多的原因,并观察炎性反应对脊髓细胞凋亡的影响。
方法:腹腔注射链脲佐菌素(Streptozocin STZ)法制作糖尿病神经痛大鼠模型,采用实时定量PCR(RT-PCR),WesternBlot技术检测糖尿病神经痛大鼠脊髓背角GABAB1,TLR2,TLR4,MyD88,TRIF,和NF-κBp65mRNA和蛋白表达的变化,采用免疫荧光法技术检测脊髓背角TLR2,TLR4,MyD88,TRIF,和NF-κBp65阳性细胞率,采用ELISA的方法检测脊髓背角中TNF-α和IL-1的表达变化,采用TUNEL法检测脊髓背角细胞凋亡情况。
结果:与对照组比较,糖尿病神经痛(DNP)大鼠脊髓背角TLR4(P<0.01,P<0.05),MyD88(P<0.05)和NF-κBp65(P<0.05,P<0.01)mRNA和蛋白表达增多,GABAB1(P<0.05)的mRNA和蛋白表达下调,TLR4(P<0.01),MyD88(P<0.01)和NF-κBp65(P<0.01)阳性细胞率增高,TLR2和TRIF没有明显差异;DNP大鼠脊髓背角炎性因子TNF-α(P<0.001)和IL-1(P<0.001)表达增多;与对照组相比,DNP大鼠脊髓背角凋亡增多(P<0.01),凋亡细胞以神经元为主,也有部分胶质细胞(n=5)。
结论:糖尿病神经痛大鼠脊髓背角TLR4/MyD88/NF-κB信号通路显著激活,而GABAB1受体表达明显下调,脊髓背角TLR2以及TRIF可能未参与糖尿病神经痛的形成。糖尿病神经痛大鼠脊髓背角炎性因子TNF-α和IL-1表达增多,神经炎症增加,并且脊髓背角细胞凋亡增多,凋亡细胞以神经元为主,也有少部分胶质细胞。
第二部分抑制脊髓TLR4/MyD88/NF-κB信号通路对大鼠糖尿病神经痛的影响及作用机制
目的:从不同位点抑制糖尿病神经痛大鼠脊髓TLR4/MyD88/NF-κB信号通路,观察对脊髓背角内该信号通路下游信号因子表达,炎性反应和细胞凋亡的影响,以及对大鼠机械缩足阈值和热缩足潜伏期的影响,阐明脊髓背角TLR4/MyD88/NF-κB信号通路在大鼠糖尿病神经痛形成和维持中的作用。
方法:采用糖尿病神经痛大鼠模型,大鼠行鞘内置管,鞘内分别给予TLR4,MyD88和NF-κB的抑制剂,探讨从不同位点抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路对糖尿病神经痛大鼠机械缩足阈值和热缩足潜伏期的影响,并取脊髓背角,采用WesternBlot技术探讨对MyD88和NF-κBp65蛋白表达的影响,采用ELISA技术探讨对炎性因子TNF-α和IL-1表达的影响,采用TUNEL法检测对脊髓背角细胞凋亡的影响。
结果:与DNP组比较,DNP+LPS-RSultrapure(选择性TLR4拮抗剂)组和DNP+MIP(MyD88拮抗剂)组大鼠在鞘内给药后第1,2,3天,DNP+SN50(NF-κB抑制剂)组大鼠在鞘内给药后第2,3天机械缩足阈值和热缩足潜伏期明显增加(P<0.05,n=12);与DNP组比较,DNP+LPS-RS组大鼠脊髓背角MyD88(P<0.01)和NF-κBp65(P<0.01)表达降低,TNF-α(P<0.001)和IL-1(P<0.001)表达减少,细胞凋亡率降低(P<0.01)((n=4);DNP+MIP组大鼠脊髓背角NF-κBp65表达降低(P<0.01),TNF-α(P<0.001)和IL-1(P<0.001)表达减少,细胞凋亡率降低(P<0.01)((n=4);DNP+SN50组大鼠大鼠脊髓背角TNF-α和IL-1表达减少(P<0.001),细胞凋亡率降低(P<0.01)((n=6)。
结论:大鼠糖尿病神经痛的形成和维持与脊髓背角TLR4/MyD88/NF-κB信号通路激活有关,从不同位点抑制该信号通路均可减轻糖尿病神经痛,并下调下游信号因子的表达。抑制糖尿病神经痛大鼠脊髓TLR4/MyD88/NF-κB信号通路可通过减少TNF-α和IL-1等细胞因子的表达减轻脊髓背角细胞凋亡。
第三部分激活GABAB受体通过抑制脊髓TLR4/MyD88/NF-κB信号通路减轻糖尿病神经痛
目的:探讨激活GABAB受体对糖尿病神经痛大鼠脊髓背角TLR4/MyD88/NF-κB信号通路以及下游炎性反应和细胞凋亡的影响,进一步阐明激活GABAB受体治疗糖尿病神经痛的作用机制。
方法:采用腹腔注射STZ的方法制作糖尿病神经痛大鼠模型并行鞘内置管,鞘内分别给予GABAB受体激动剂和阻断剂,观察其对糖尿病神经痛大鼠机械缩足阈值和热缩足潜伏期的影响,并取脊髓背角,采用WesternBlot技术和免疫荧光技术探讨其对TLR4,MyD88和NF-κBp65表达的影响,采用ELISA技术检测对下游炎性因子TNF-α和IL-1表达的影响,采用TUNEL法检测对脊髓背角细胞凋亡的影响。
结果:与DNP组比较,DNP+Baclofen(GABAB受体激动剂)组大鼠在鞘内给药后第1,2,3天机械缩足阈值和热缩足潜伏期明显增加(P<0.05,n=16),脊髓背角TLR4(P<0.01,P<0.05),MyD88(P<0.05)和NF-κBp65(P<0.05,P<0.01)蛋白表达和阳性细胞率降低,TNF-α(P<0.001)和IL-1(P<0.001)表达减少,细胞凋亡率降低(P<0.05)(n=4);DNP+Saclofen(GABAB受体阻断剂)组大鼠在给药后第2,3天机械缩足阈值和热缩足潜伏期明显降低(P<0.05,n=16),脊髓背角TLR4(P<0.05),MyD88(P<0.05)和NF-κBp65(P<0.05,P<0.01))蛋白表达和阳性细胞率增高,TNF-α(P<0.001)和IL-1(P<0.001)表达增加(n=4)。
结论:激活GABAB受体能够减轻大鼠糖尿病神经痛,其机制与抑制脊髓背角TLR4/MyD88/NF-κB信号通路,下调下游炎性因子TNF-α和IL-1的表达,减轻神经炎症,减少细胞凋亡有关。