【摘 要】
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Argonaute（Ago）蛋白质是一种可编程核酸酶,广泛分布于真核生物和原核生物。真核生物Ago蛋白质在RNA干扰途径中起关键作用,能够在小RNA或者小DNA的引导下识别甚至切割与之互补的RNA。原核生物Ago蛋白质可能参与宿主防御和DNA复制,偏爱在小DNA的引导下切割与之互补的DNA。Ago蛋白质已经在核酸检测和遗传操作等方面得以应用,为了进一步拓展基于Ago蛋白质的核酸操作工具,我们通过生
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Argonaute（Ago）蛋白质是一种可编程核酸酶,广泛分布于真核生物和原核生物。真核生物Ago蛋白质在RNA干扰途径中起关键作用,能够在小RNA或者小DNA的引导下识别甚至切割与之互补的RNA。原核生物Ago蛋白质可能参与宿主防御和DNA复制,偏爱在小DNA的引导下切割与之互补的DNA。Ago蛋白质已经在核酸检测和遗传操作等方面得以应用,为了进一步拓展基于Ago蛋白质的核酸操作工具,我们通过生物信息学手段检索到一种来源于甜瓜黑点根腐病菌又称坎诺单孢菌（Monosporascus cannonballus）的Ago蛋白质（McAgo）。McAgo的氨基酸序列与已报道的Ago蛋白质的序列一致性不超过25%,但具有保守的催化四联体氨基酸DEDD,推测McAgo可能是一个新的有活性的Ago蛋白质。将McAgo基因经大肠杆菌密码子优化后克隆到p ET28a载体上,后续为了更好的纯化在McAgo基因的N端融合CL7标签并通过IM7-CL7纯化方法得到了高纯度的McAgo蛋白质。核酸提取实验表明McAgo与大多数Ago蛋白质一样结合有20-33 nt的小RNA。活性测定实验表明,McAgo能以5′端磷酸化或羟基化的RNA为引导来切割与之互补的RNA,并且切割位点位于引导链5′到3′的10到11个碱基之间。McAgo需要二价金属离子来激活切割,且在Mg2+条件下效果最好。此外,McAgo在氯化钠浓度为50-750 m M,p H 6.8-8.8条件下都能有效切割靶RNA。McAgo对引导RNA（g RNA）的5′端首位碱基没有明显的偏好性;McAgo能在30-61℃范围内切割RNA,最适温度为42℃;圆二色谱分析表明,g RNA与McAgo形成的二元复合物的热稳定性相比于空的McAgo提高,熔解温度（Tm）从48.8℃提升到58.5℃;McAgo能使用12-30 nt长度的g RNA来切割靶RNA,g RNA的长度为20 nt和21 nt时切割效率最高;McAgo具有单碱基专一性并且是一个多转换数的酶。综上McAgo具有潜在的应用价值,例如以McAgo为核心开发高灵敏度的核酸检测方法,以及作为RNA水平调控工具等等,McAgo蛋白质的发现和生化性质的探究为基于Ago蛋白质的应用提供了新的可能性。
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