研究背景:由创伤、感染、肿瘤等多种因素引起的口腔颌面部骨组织缺损在临床上越来越常见,严重影响患者的饮食、美观和心理健康。传统疗法存在各种各样的缺点:异体骨移植会引起免疫排斥反应,自体骨抑制会造成身体其他部位骨组织的缺失,支架材料未能有理想的生物相容性。因此,发展一种新型有效的修复骨组织的方法是十分必要的。转基因疗法是目前治疗骨缺损的研究热点,但是单纯基因不稳定且易被降解,因此需要基因载体对基因进行保护。病毒载体转染效率高,但是往往会引起免疫反应,生物毒性不容忽视。而非病毒载体特别是纳米粒子,粒径较小,比表面积较大,易被修饰,越来越多地应用于转基因治疗中。碳点作为一种新型的纳米粒子,成本低廉,制作方便,且多有优良的光致发光的特点,可被应用于生物传感、生物成像中,具有成为优良的转基因治疗基因载体的性能。因此,研究碳点跨成骨类细胞膜转运途径和胞内分布,探索其生物相容性,对碳点作为非病毒基因载体具有重要的意义。研究目的:探讨抗坏血酸碳点的生物相容性,明确抗坏血酸碳点进入MC3T3细胞的途径和在细胞内的分布,为未来抗坏血酸碳点作为非病毒基因载体应用于口腔颌面部骨缺损的转基因治疗提供理论基础。研究方法:采用微波法制备抗坏血酸-PEI复合碳点。采用MTT法检测碳点对细胞增殖的影响,Annexin V-PITC/PI双染法经流式细胞仪检测碳点对细胞凋亡的影响。同时检测细胞周期、细胞内ATP水平、细胞内ROS水平来评估碳点的生物相容性。通过各内吞抑制剂的使用,结合流式细胞术明确MC3T3细胞摄取碳点的途径,并通过原子力显微镜和透射电镜的使用加以验证。通过标记各细胞器,结合碳点本身的绿色荧光明确碳点在亚细胞结构上的分布,并通过透射电镜的使用加以验证。研究结果:碳点可在蓝色荧光下激发发射绿色荧光,进入细胞后主要分布在细胞质中,能较好地显示细胞的轮廓。当用40 mg·L-1的碳点处理细胞24h后,细胞增殖率尚在80%以上。碳点对细胞的早期凋亡率影响不大(P>0.05)。碳点能降低G0、G1期细胞的比例(P<0.05),上升S期细胞的比例(P<0.05)。碳点能够上升细胞的ROS水平,但不明显(P>0.05)。碳点会降低细胞的ATP水平(P<0.05)。当采用氯丙嗪来抑制网格蛋白介导的胞饮作用时,碳点的细胞摄取率降低;当采用诺考达唑或4℃孵育来抑制能量依赖性的内吞途径时,碳点的细胞摄取率下降明显(P<0.05),但尚有碳点能够被细胞摄取。将碳点与细胞共孵育15min后,与空白对照组相比,细胞表面的起伏变大,并且产生许多直径在100nm左右的凹陷,但当碳点与细胞共孵育3h后,细胞膜表面趋于平缓,且细胞膜表面的凹陷减少。透射电镜的结果表明,碳点进入细胞的时候伴随着细胞膜的内陷。碳点的绿色荧光与标记溶酶体、线粒体的红色荧光重叠得较好,但与标记内质网的红色荧光只有部分重叠,而标记高尔基体的红色荧光则不是很明显。透射电镜的结果表示,在内质网、线粒体和溶酶体上都可以发现碳点的影像,未见明显的高尔基体。此外,在细胞核内也可以发现碳点的影像。研究结论:1.碳点具有激发依赖性,能够在蓝色荧光的激发下发射绿色荧光,也能够在绿色荧光的激发下发射红色荧光,但主要发射绿色荧光。碳点具有良好的显微细胞成像能力,能够进入细胞,主要分布在细胞质中,能较好地显示细胞的轮廓。碳点的细胞毒性较低,生物相容性较好。2.碳点可以通过网格蛋白介导的胞饮作用内吞进入细胞,也能通过非能量依赖性的途径进入细胞,碳点进入细胞前可发生聚集,可伴随相应区域细胞膜的内陷。3.碳点内吞进入细胞后主要分布在细胞的内膜系统上,在溶酶体、线粒体和内质网上都有分布,可包裹在囊泡内在细胞内进行运输。此外,碳点还能进入细胞核。