外伤性脑损伤(traumatic brain injury, TBI)是神经科的常见疾病,发病率极高,目前人们已经清楚其病理学改变包括原发性损伤和继发性损伤两个阶段。TBI后通过炎症反应、谷氨酸兴奋毒性、自由基生成和脂质过氧化、离子失衡、细胞凋亡等多种相关的病理机制导致脑损伤区周围更广泛的神经元继发性死亡,炎性反应在其中发挥关键性作用。中枢神经系统炎症反应主要表现为小胶质细胞和星形胶质细胞的活化。小胶质细胞的激活增殖,产生自由基、超氧化物阴离子、一氧化氮、肿瘤坏死因子A、白细胞介素1、前列腺素E等多种细胞毒物质,导致神经元变性坏死。活化的星形胶质细胞还可转化成iNOS阳性细胞器,产生NO,加重继发性脑损伤。研究证实TBI后脑皮层和海马等脑区发生的不可控性炎性反应,通过活化的星形胶质和小胶质细胞释放细胞毒物质,引发大量神经元损害及死亡是其主要病理机制之一。海马CA1区负责分辨学习,CA3区参与长期记忆保持,TBI后海马CA1、CA3和齿状回等部位神经细胞丢失,突触传递功能的改变,是造成认知记忆障碍的原因。过氧化物酶增殖因子活化受体γ(peroxisome-proliferator-activated receptor-y,PPARγ)是核激素受体超家族中的配体激活转录因子,在调控细胞增殖、分化和炎性反应中起重要作用。目前PPARγ激动剂吡咯列酮(pioglitazone, Pio)在脑缺血、脊髓损伤、实验性自身免疫性脑脊髓炎、帕金森综合症等中枢神经损伤及神经退行性疾病动物模型上的抗炎及神经保护作用备受关注。吡格列酮是噻唑烷二酮类药物,为PPARγ的合成激动剂。PPARγ与之结合后激活,能抑制细胞因子、黏附分子和金属蛋白酶而抑制炎性细胞从外周进入中枢,能通过抑制NF-κB和JAK-STAT信号通路的活性而抑制中枢神经系统损伤中的炎症和氧化应激。有实验证明PPARγ激动剂能抑制原代培养的星形胶质细胞和小胶质细胞中细胞因子信号抑制剂SOCS1、3的表达,后者能通过降低JAK的磷酸化而抑制JAK-STAT信号通路,通过共价修饰一种抑制蛋白IκB激酶降低NF-κB的表达从而抑制NF-κB信号传导通路。此外,吡咯列酮能抑制谷氨酸和低钾导致的神经毒性。这提示PPARγ可能是中枢神经系统急慢性损伤治疗的新靶点。临床TBI后发生的认知功能障碍是影响幸存者生活质量的关键因素。现对脑损伤性认知功能障碍的病理生理机制仍不清楚,因而临床缺少合理有效的治疗。我们设想吡咯列酮能够抑制TBI大鼠海马区星形胶质和小胶质细胞炎性反应,减少神经元的死亡,从而改善动物认知行为。因此,本工作在自动控制脑损伤撞击仪制备的大鼠左侧脑顶叶皮层损伤实验模型上,利用Morris水迷宫实验和OX-42、GFAP和NeuN免疫组化染色的方法,研究了吡咯列酮对大鼠记忆认知行为和海马CA1和CA3区小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元数量的影响；在体外培养的大鼠皮层和海马神经细胞实验模型上,观察了吡格列酮对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)所致的体外培养皮层和海马神经元损伤的神经保护作用。这对阐明TBI认知功能障碍的病理机制,发现有效地治疗药物和手段具有重要理论意义和临床应用价值。主要实验结果如下：一、吡格列酮对TBI大鼠记忆认知功能的作用为证明吡格列酮能够改善TBI大鼠的记忆认知障碍,本工作采用Morris水迷宫实验(morris water maze, MWM)测试动物通过空间位置觉和方向觉的学习记忆能力,进而判断其认知功能。实验分为假手术组(Sham组),脑损伤溶剂注射组(Vehicle组),吡格列酮治疗组(Pio组)和吡格列酮+阻断剂组(Pio+Ant组)。结果发现各实验组大鼠找到水中平台的潜伏期和游泳轨迹随MWM训练次数的增多而缩短,说明大鼠具备空间学习与记忆能力。在MWM第2天到第4天各实验组两两比较其潜伏期和游泳轨迹具有显著性差异。取这3d各组数据均值进行统计学分析发现Vehicle组大鼠MWM潜伏期和游泳轨迹分别为40.07±10.31s、851.58±209.95cm,较Sham组大鼠潜伏期19.59±6.42s及游泳轨迹477.27±190.12cm明显增长(P均<0.01)；Pio组大鼠潜伏期和游泳轨迹分别为21.82±6.90s和629.30±203.37cm,比Vehicle组显著缩短(P均<0.05)；应用PPARγ阻断剂T0070907后,潜伏期和游泳轨迹分别为39.81±10.64s、888.51±279.29cm,均比Pio组大鼠延长(P均<0.05)。分别将Pio组大鼠潜伏期和游泳轨迹与Sham组大鼠,以及Vehicle组与Pio+Ant组比较,两者之间无显著性差异。各组大鼠游泳速度无显著性差异,说明上述组间平台潜伏期的差异不是由大鼠游泳能力变化引起的。结果提示大鼠皮层顶叶中、内侧部撞击伤可引起空间认知功能的减弱,吡格列酮能够通过PPARγ受体的介导,提高TBI大鼠的空间认知能力。二、吡格列酮对TBI大鼠海马小胶质细胞的作用本实验在大鼠TBI实验模型上,利用OX-42免疫组化染色和细胞计数的方法,研究了吡格列酮对TBI大鼠海马区小胶质细胞活化导致的炎性反应的影响。结果显示,正常Sham组大鼠海马小胶质细胞呈分支状,体积小,突起细而短,染色浅；Vehicle组大鼠海马小胶质细胞染色深,胞体增大,细胞为阿米巴状,突起长而粗,呈现活化小胶质细胞的表征；应用Pio后大鼠海马小胶质细胞活化程度明显减弱,该效应被T0070907翻转。细胞计数结果显示Vehicle组海马CA1和CA3区小胶质细胞数量为327±7.0个,与Sham组206.6±8.9个相比,差异非常显著(P<0.01)；Pio组为218±9.02个,比Vehicle组显著减少(P<0.01),与Pio+Ant组324.2±4.91个比较,差别显著(P<0.01)。结果提示TBI可引起大鼠海马小胶质细胞的增殖活化,吡咯列酮能够通过PPARγ受体减弱TBI后大鼠海马小胶质细胞的炎性反应。三、吡格列酮对TBI大鼠海马星形胶质细胞的作用本实验在大鼠TBI实验模型上,利用GFAP免疫组化和细胞计数的方法,研究了毗格列酮对TBI大鼠海马区星形胶质细胞的反应。结果发现Sham组大鼠正常海马星形胶质细胞呈星芒状,突起分支细而少；而Vehicle组大鼠海马星形胶质细胞染色明显加深,突起分支增多、增粗、变长,分布密集,表现为活化状态；应用Pio治疗后大鼠海马星形胶质细胞活化程度明显较Vehicle大鼠减轻；Pio+Ant组大鼠海马仍表现一定程度的星形胶质细胞反应。细胞计数得出Vehicle组大鼠海马CA1和CA3区GFAP阳性细胞数量为216.44±33.94个,较Sham组152.33±15.66个显著增多(P<0.01)；Pio组星形胶质细胞数量是172.44±29.78个,比Vehicle组或Pio+Ant组201.16±30.51个明显减少(P均<0.05)。结果提示吡咯列酮可以减轻TBI大鼠海马星形胶质细胞的增殖活化,PPARγ受体介导该效应。四吡格列酮对TBI大鼠海马神经元的保护作用本实验利用NeuN(神经元核蛋白)免疫组化染色和细胞计数的方法,探讨了吡格列酮能否通过减少TBI大鼠小胶质细胞和星形胶质细胞炎性反应,发挥对海马神经元的保护作用。结果显示Sham组大鼠正常海马神经元排列整齐,结构层次分明、胞体和突起清晰可见,NeuN蛋白表达强；Vehicle组大鼠海马神经元细胞数量较正常显著减少、细胞肿胀、排列紊乱、边界不清、NeuN染色变浅；而Pio治疗组大鼠海马区神经元细胞轮廓较TBI组和Pio+Ant组大鼠清晰饱满、NeuN蛋白表达增强。细胞计数得出,Sham组大鼠海马CA1和CA3区神经元数量为253.50±9.33个,Vehicle组为158.00±6.92个,两者比较差异非常显著(P<0.01)；Pio组大鼠海马该区神经元为199.66±8.87个,较Vehicle组和Pio+Ant(160.66±7.75个)显著增多(P均<0.05)；Vehicle组与Pio+Ant组比较无显著性差异。结果提示吡咯列酮能够通过PPARγ增强TBI大鼠海马神经元NeuN蛋白表达,减轻神经元的损伤和死亡。五吡格列酮对体外培养的新生大鼠胆碱能神经元的保护作用本实验在体外培养的新生大鼠皮层和海马胆碱能神经元实验模型上,利用ChAT免疫细胞化学染色及细胞计数的方法,研究了吡格列酮对LPS所致的胆碱能神经元炎性反应的影响。实验分为对照组(Control组),脂多糖致炎组(LPS组)和吡格列酮治疗组(LPS+Pio组)。结果发现Control组大鼠正常胆碱能神经元饱满,胞体和突起清晰可见,ChAT蛋白表达强；LPS组大鼠胆碱能神经元细胞数量较正常显著减少、细胞肿胀、边界不清、ChAT染色变浅；而Pio+LPS组大鼠胆碱能神经元细胞轮廓较LPS组大鼠清晰饱满、突起多,细胞间的突触联系多,ChAT蛋白表达增强。细胞计数显示Control组的ChAT阳性细胞数为65.16±3.18个／视野,与LPS组33.83±3.43个／视野相比差异显著(P<0.01)；Pio+LPS组ChAT阳性细胞数为59.50±7.06个／视野比LPS组的细胞数明显增多(P＜0.01)。提示吡格列酮能够直接降低LPS导致的新生大鼠皮层和海马胆碱能神经元的炎性损伤,从而发挥神经元的保护作用。结论：1.吡格列酮能够通过PPARγ介导提高TBI大鼠MWM的记忆认知能力。2.吡咯列酮能够通过PPARγ介导减弱TBI大鼠海马CA1和CA3区小胶质细胞的增殖活化反应。3.吡咯列酮能够通过PPARγ介导减轻TBI大鼠海马CA1和CA3区星形胶质细胞的反应。4.吡咯列酮能够增强TBI大鼠海马CA1和CA3区神经元NeuN蛋白表达,减少神经元的损伤和死亡。5.吡咯列酮具有对LPS所致体外培养的新生大鼠皮层和海马胆碱能神经元炎性损伤和死亡的神经保护作用。