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目的采取高脂高糖饮食+STZ诱导法构建糖尿病合并肝损伤(NAFLD、NASH、肝纤维化)的大鼠模型,探讨石斛合剂序贯法(dendrobium mixture in order cycle method,DMOC)干预糖尿病合并肝损伤及肝纤维化的疗效及其作用机制。方法健康清洁级SD雄性大鼠五周龄(体重180±10g左右)40只,由台湾乐斯科生物科技股份有限公司购买。适应性喂养1周后实验大鼠随机分成4组:①Con组(基本饲料,n=10)、②DMOC组(基本饲料+DMOC配方,n=10)、③DMF组(高脂高糖+STZ,n=10)、④DMF+DMOC组(高脂高糖+STZ+DMOC配方,n=10),①②为控制组;③④为诱导组。各组实验大鼠分别喂食相对应饲料并提供逆渗透水饮用,喂养4周后③④诱导组以腹腔注射2次STZ(25mg/kg+m2,间隔72h),注射后第4天,用血糖测定仪测量血糖,筛选空腹血糖>11.1mmol/L、糖化红蛋白>17%为糖尿病造模成功大鼠。③④诱导组造模显示该饮食处理后大鼠出现高血糖、高血脂、肝功能异常现象,喂养至36周后③④诱导组活检显示有显着肝纤维化倾向,第36-44周②④组进行DMOC中药干预。每周称重1次,根据体重调整灌胃药量,分别喂养长达44周末进行取材。观察每组动物的健康状况、体重、脏器重量、血清学检测FBG、TC、TG、AST、ALT、ROS、TNF-α、IL-6、TGF-β1等指标。HE和Masson三色染色法观察肝损伤及肝纤维化变化情况。IHC法检测肝组织α-SMA、Fibrinogen、Ⅳ-Collagen 变化情况。WB 法检测 Smad2、Smad3、pSmad2、pSmad3、α-SMA、MMP1、MMP2、MMP9 的蛋白表达变化情况。结果1 DMOC干预糖尿病合并肝损伤的动物模式1.1大鼠一般情况观察:控制组大鼠一般情况良好,进食正常,毛色有光泽,体重稳步增加,大便呈颗粒状。诱导组大鼠均有不同程度的进食减少,精神萎靡、嗜睡,皮毛晦暗,体重增加,便溏。1.2大鼠体重变化情况:DMOC干预前,与Con组比DMF组的体重显著着升高,差异有统计学意义(P<0.01);DMOC干预后,DMOC+DMF组与DMF组比,体重显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结果显示糖尿病会使体重增加,而DMOC有改善体重变化情况。1.3大鼠肝组织重量变化情况:DMOC干预前,与Con组比DMF组的肝组织重量显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);DMOC干预后,DMOC+DMF组与DMF组比,肝组织重量显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结果显示糖尿病会使肝组织肿大,而DMOC有改善肝组织重量的作用。1.4大鼠腹腔脂肪重量变化情况:DMOC干预前,与Con组比DMF组的腹腔脂肪重量均显著升高,差异有统计学意义(P<0.01);DMOC干预后,DMOC+DMF组与DMF组比,腹腔脂肪重量均显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结果显示糖尿病会使腹腔脂肪堆积,而DMOC有减少腹腔脂肪堆积的作用。1.5大鼠空腹血糖变化情况:DMOC干预前,与Con组比DMF组的空腹血糖显著升高,差异有统计学意义(P<0.01);DMOC干预后,DMOC+DMF组与DMF组比,空腹血糖显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结果显示DMOC可有效降低糖尿病大鼠的空腹血糖功能。1.6大鼠血脂变化情况:DMOC干预前,与Con组比DMF组的总胆固醇、三酰甘油酯均显著升高,差异有统计学意义(P值均<0.01);DMOC干预后,DMOC+DMF组与DMF组比,总胆固醇、三酰甘油酯均显著降低,差异有统计学意义(P<0.05、P<0.01)。结果显示糖尿病罹病时间增长,血脂有上升的趋势,而DMOC具有推迟糖尿病大鼠血中总胆固醇上升及降低三酰甘油酯的功效。1.7大鼠肝功能变化情况:DMOC干预前,与Con组比DMF组的AST与ALT均显著升高,差异有统计学意义(P值均<0.01);DMOC干预后,与DMF组比,DMF+DMOC组的AST显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)与ALT降低20%,差异无统计学意义(P>0.05)。结果显示糖尿病会引起肝损伤,而DMOC能减缓糖尿病对肝脏的伤害。1.8大鼠肝组织HE染色观察肝损伤情况:DMOC可明显改善肝细胞泡沫样变、细胞肿胀、界线不清、肝窦狭窄、中央静脉周围伴汇管区少量淋巴细胞浸润程度。2 DMOC干预糖尿病合并肝损伤尤其肝纤维化的作用机制2.1大鼠血清自由基ROS变化情况:DMOC干预前,与Con组比DMF组的自由基ROS显著升高,差异有统计学意义(P<0.01);DMOC干预后,DMOC+DMF组与DMF组比的自由基ROS显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结果显示糖尿病会使肝组织自由基ROS增加,而DMOC干预后可明显减少。2.2大鼠血清炎性细胞因子TNF-α变化情况:DMOC干预前,与Con组比DMF组的TNF-α显著升高,差异有统计学意义(P<0.01);DMOC干预后,DMOC+DMF组与DMF组比的炎性细胞因子TNF-α显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结果显示糖尿病会使肝组织炎性细胞因子TNF-α表达增加,而DMOC干预后可明显减少炎性细胞因子TNF-α的表达。2.3大鼠血清炎性细胞因子IL-6变化情况:DMOC干预前,与Con组比DMF组的IL-6显著升高,差异有统计学意义(P<0.01);DMOC干预后,DMOC+DMF组与DMF组比的炎性细胞因子IL-6显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结果显示糖尿病会使炎性细胞因子IL-6增加,而DMOC干预后可明显改善炎性细胞因子IL-6的表达。2.4大鼠血清纤维化因子TGF-β1变化情况:DMOC干预前,与Con组比DMF组的TGF-β1显著升高,差异有统计学意义(P<0.01);DMOC干预后,DMOC+DMF组与DMF组比的TGF-β1显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结果显示糖尿病会使促纤维化因子TGF-β1增加,而DMOC干预后可明显减少促纤维化因子TGF-β1的表达。2.5大鼠肝组织Masson三色染色法观察胶原纤维变化情况:糖尿病会引起肝纤维化,而DMOC可抑制大鼠肝组织细胞坏死、炎性细胞浸润与胶原纤维增生。2.6大鼠肝组织IHC法观察α-SMA、Fibrinogen、Ⅳ-Collagen变化情况:糖尿病会引起肝纤维化,而DMOC对于肝细胞受损诱导α-SMA、Fibrinogen、Ⅳ-Collagen的活化有明显的抑制效果。2.7大鼠肝组织WB法观察pSmad2/Smad2、pSmad3/Smad3、α-SMA的蛋白表达情况:DMOC 干预前,与 Con 组比,DMF 组的 pSmad2/Smad2、pSmad3/Smad3、α-SMA/β-actin相对密度增加,差异有统计学意义(P值均<0.01);DMOC干预后,DMOC+DMF 组与 DMF 组比 pSmad2/Smad2、pSmad3/Smad3、α-SMA/β-actin 相对密度减少,差异有统计学意义(P值均<0.01)。结果显示糖尿病会引起肝纤维化,虽然Smad2、Smad3表达各组均无明显差异,而DMOC对pSmad2、pSmad3、α-SMA的蛋白表达有明显的抑制效果。2.8大鼠肝组织WB法观察MMP 1、MMP 2、MMP 9蛋白表达变化情况:DMOC干预前,与 Con 组比 DMF 组的 MMP1/β-actin、MMP2/β-actin、MMP9/β-actin 相对密度表现减少,差异有统计学意义(P值均<0.01);DMOC干预后,DMOC+DMF组与DMF组比的MMP1/β-actin、MMP2/β-actin、MMP9/β-actin相对密度显著增加,差异有统计学意义(P值均<0.01)。结果显示糖尿病会引起肝纤维化,而DMOC可增加MMP1、MMP2、MMP9蛋白表达,促进胶原蛋白分解。结论1高脂高糖饮食+STZ造模的糖尿病合并肝损伤大鼠,可损伤胰腺组织导致分泌胰岛素的功能受损,最后诱发出高血糖症,继续观察有显著肝损伤及肝纤维化。此模式与“西方饮食”习惯所造成的T2DM合并肝损伤及肝纤维化相接近。2 DMOC可改善糖尿病合并肝损伤模型伴有肝纤维化大鼠的体重、肝组织重量、腹腔脂肪重量、FBG、TC、TG、AST、ALT、ROS、TNF-α IL-6、TGFβ1 异常的情况。3 DMOC可改善糖尿病合并肝纤维化大鼠肝组织的泡沫样变、细胞肿胀、界线不清、肝窦狭窄、中央静脉周围伴汇管区少量淋巴细胞浸润程度,减少α-SMA、Fibrinogen、Ⅳ-Collagen等胶原纤维的沉积。其机制可能与DMOC抑制糖尿病合并肝纤维化模型大鼠ROS→TNF-α、IL-6的炎性、TGFβ1→Smads→α-SMA肝纤维化信号通路;促进MMP1、MMP2、MMP9蛋白表达,增加Fibrinogen、Ⅳ-Collagen胶原蛋白的降解有关。