【摘 要】
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泽泻汤为古代经典名方,出自东汉张仲景《金匮要略》,由泽泻与白术以5:2比例配伍组成,现代临床及实验研究表明泽泻汤具有治疗高脂血症的药理作用。在此研究基础上,为进一步揭示泽泻汤化学成分,探究泽泻汤是否具有预防与治疗非酒精性脂肪肝的作用,并探讨发挥作用的关键药效物质,本论文采用UPLC-MS/MS高分辨质谱技术鉴定泽泻汤主要化学成分及入血成分,并对泽泻汤水及乙醇提取物化学成分进行比较;采用油酸诱导的H
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泽泻汤为古代经典名方,出自东汉张仲景《金匮要略》,由泽泻与白术以5:2比例配伍组成,现代临床及实验研究表明泽泻汤具有治疗高脂血症的药理作用。在此研究基础上,为进一步揭示泽泻汤化学成分,探究泽泻汤是否具有预防与治疗非酒精性脂肪肝的作用,并探讨发挥作用的关键药效物质,本论文采用UPLC-MS/MS高分辨质谱技术鉴定泽泻汤主要化学成分及入血成分,并对泽泻汤水及乙醇提取物化学成分进行比较;采用油酸诱导的HepG2细胞脂肪累积模型,评价泽泻汤水提取物及乙醇提取物体外抗非酒精性脂肪肝的作用,利用RT-qPCR技术探究泽泻汤抗非酒精性脂肪肝作用机制;建立泽泻和白术不同配伍比例的泽泻汤提取物的化学指纹色谱,结合其对HepG2细胞脂肪累积的抑制作用,进行谱效研究,筛选泽泻汤抗非酒精性脂肪肝药效成分;采用分子对接技术验证筛选出的潜在药效成分与非酒精性脂肪肝相关蛋白的结合能力,初步阐明药效成分作用的分子机制。具体研究内容如下:1.基于LC-MS的泽泻汤主要化学成分及入血成分研究采用UPLC-Q-TOF高分辨质谱技术,鉴定泽泻汤水及乙醇提取物主要化学成分,通过优化液相条件,实现泽泻汤两种提取物化学成分同时进行分离和分析。采用正离子模式进行检测,通过与对照品及相关文献进行对比,根据色谱峰保留时间、精确分子质量和多级质谱碎片信息,从泽泻汤中共鉴定出24个色谱峰,主要为三萜类和倍半萜类化学成分,并发现泽泻汤水提物与乙醇提取物中三萜类化学成分的种类和含量存在较大差异。泽泻汤提取物口服灌胃大鼠后,收集大鼠血清,采用UPLC-Q-Exactive轨道阱高分辨质谱技术分析泽泻汤入血成分,共发现4个泽泻汤入血原形成分。上述实验结果为泽泻汤进一步的化学及药效研究提供了基础。2.泽泻汤抑制油酸诱导的HepG2细胞脂肪累积作用研究采用油酸诱导的HepG2细胞脂肪累积模型,评价泽泻汤水及乙醇提取物抗非酒精性脂肪肝的能力。泽泻汤水及乙醇提取物在给药浓度为80与160 mg/mL时能极显著降低HepG2细胞脂肪累积量(P<0.01),40 mg/mL浓度能显著降低HepG2细胞脂肪累积量(P<0.05),两提取物均表现出较好的剂量依赖性,且乙醇提取物表现出更强的抑制作用,表明泽泻汤具有潜在治疗非酒精性脂肪肝的作用。利用RT-qPCR技术分析了泽泻汤提取物对脂肪酸代谢、胆固醇代谢及炎症反应相关基因的调控,发现泽泻汤可能通过影响PPARα、HMG CR、ACC、FAS及NF-κB等基因的表达来减少胆固醇和脂肪酸的合成,加快脂质的分解和运输,减轻肝脏炎症反应来产生治疗非酒精性脂肪肝的作用。3.泽泻汤抑制油酸诱导的HepG2细胞脂肪累积作用谱效关系研究采用UPLC-Q-TOF高分辨质质谱技术,建立泽泻和白术不同配伍比例泽泻汤提物指纹图谱,并考察其对HepG2细胞脂肪累积的抑制作用,对泽泻汤抗非酒精性脂肪肝作用进行谱效关系研究。利用中药指纹图谱相似度评价软件对色谱图进行匹配并给出共有峰及峰面积,建立以峰面积为自变量,HepG2细胞脂肪累积抑制能力为因变量的数据集,采用聚类分析、相关分析、灰色度关联分析及偏最小二乘回归分析进行谱效分析,考察各色谱峰与药效的相关性,最终发现alisol B 23-acetate、alisol B、16-oxo-11-anhydro-alisol A、alisol L、alisol C 23-acetate、atractylenolide Ⅰ 和tetradecylcitric acid 7个化学成分与药效相关性较强。4.基于分子对接技术的泽泻汤药效成分验证利用MOE软件对筛选出的三萜类药效成分与FXR蛋白进行模拟对接,发现筛选出的5个潜在药效成分均可通过空间互补、氢键及范德华力与FXR蛋白发生结合,且相对活性为 alisol B 23-acetate>alisol C23-acetate>alisol L>16-oxo-11-anhydro-Alisol A>alosol B,其中 alisol B 23-acetate 与 alisol C 23-acetate 及 alisol L 的最佳构象对接自由能数值较为接近,对接活性相似,1 6-oxo-11-anhydro-AlisolA与alosolB的对接能力低于其他三个化合物,5个化合物均可与FXR发生结合,可能作为FXR激动剂发挥其抗非酒精性脂肪肝作用。综上所述,本文从谱效相关性角度对泽泻汤主要化学成分及体外抗非酒精性脂肪肝潜在药效成分进行研究,不仅为泽泻汤进一步化学及药效研究提供了基础,也为寻找非酒精性脂肪肝治疗药物提供了重要依据。
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