银杏二萜内酯葡胺注射液是江苏康缘药业股份有限公司开发的中药五类新药,是以银杏二萜内酯为原料,采用葡甲胺作为增溶剂制备而成。银杏二萜内酯原料系银杏科植物银杏Ginkgo biloba L.的干燥叶经过加工制成的提取物,主要含有银杏内酯A、B、K等成分,在注射液中银杏内酯类化合物主要以开环形式存在。由于银杏内酯类化合物在生物体内以开环和闭环形式同时存在,且银杏内酯类化合物的开环对照品难获得,因此同时研究银杏二萜内酯葡胺注射液中各内酯类成分开环、闭环的药代动力学特征存在很大难度。本研究通过液液萃取和酸化后液液萃取方法分别测定银杏内酯A、B、K在不同生物样品中的闭环物质和总闭环物质浓度,间接获得银杏内酯A、B、K的开环物质浓度。从而对银杏二萜内酯葡胺注射液在生物体内开、闭环状态下的主要成分进行全面的药代动力学研究,系统阐述其在生物体内的血浆经时过程、组织分布、代谢和排泄过程及特点,进而揭示药物在生物体内的动态变化规律。本论文具体研究内容包括:1、银杏内酯A、B、K在不同生物基质中LC-MS/MS分析方法的建立运用LC-MS/MS技术建立大鼠血浆、胆汁、尿液、粪便和Beagle犬血浆中银杏内酯A、B、K 一系列酸化生物样品的测定方法。结果表明,以上方法的专属性、灵敏度、精密度、准确度、提取回收率、基质效应、样品稳定性等均符合生物样品的测定要求。同时,利用酸化血浆随行标曲对未酸化血浆样品的精密度进行验证,结果亦符合检测要求,说明银杏内酯A、B、K在酸化血浆中的LC-MS/MS测定方法可同时用于未酸化和酸化血浆样品的检测。2、银杏二萜内酯葡胺注射液在大鼠体内的药代动力学研究本部分系统研究了银杏二萜内酯葡胺注射液在大鼠血浆中的经时过程、组织分布、代谢和排泄动力学过程,研究结果如下:（1）单次给药的血浆经时过程:单次给药后,大鼠体内开、闭环及总银杏内酯A、B、K的系统暴露量（AUC0-∞）与给药剂量均成正比（r>0.9）,提示单次给药后银杏内酯A、B、K在大鼠体内的经时行为呈线性动力学过程,且开、闭环内酯类化合物在大鼠体内存在动态变化,两者比例随时间延长逐渐降低,最终达到稳态。（2）多次给药的血浆经时过程:多次给药后,大鼠体内开、闭环及总银杏内酯A、B、K的消除半衰期和系统暴露量与单次给药相比,均无显著性差异（p>0.05）,提示多次给药后银杏内酯A、B、K在大鼠体内的消除速度无明显变化,且不存在体内蓄积作用,说明在所选则的剂量范围内用药安全。（3）组织分布研究:单次给药后,银杏内酯A、B、K在大部分组织中均有分布,5 min即可在大多数组织中的药物浓度达到峰值,其中肾浓度最高,肝、肠、心脏、肺脏、脾脏、胰腺、脂肪、肌肉、皮肤、卵巢次之,虽然脑中药物分布相对较少,但主要以开环形式存在,说明开环形式的银杏内酯化合物可透过血脑屏障,可能为注射液发挥药效的物质基础。（4）排泄研究:单次给药后,总银杏内酯B在尿液中的累计排泄分数较高,约为43.9%,说明其可能主要通过肾脏排泄;而总银杏内酯K在粪便中的累计排泄分数较高,约为63.7%,说明其可能主要通过肠道排泄;总银杏内酯B、K在尿液和粪便的总累积排泄率分别约为70.4%和86.1%,接近物料平衡,总银杏内酯A在尿液和粪便中的累计排泄率约为50.3%,可能在体内存在生物转化。3、银杏二萜内酯葡胺注射液在Beagle犬体内的药代动力学研究本部分系统研究了银杏二萜内酯葡胺注射液单、多次给药后在Beagle血浆中的经时过程,研究结果如下:（1）单次给药的血浆经时过程:单次给药后Beagle犬体内开、闭环及总银杏内酯A、B、K的系统暴露量（AUC0-∞）与给药剂量成正比（r>0.9）,提示单次给药后银杏内酯A、B、K在Beagle犬体内的经时行为呈线性动力学过程,消除较快,该结果为药物在临床应用的方式体统了佐证;此外,开、闭环内酯类化合物在Beagle犬体内存在动态变化,两者比例随时间延长逐渐降低,最终达到稳态,该变化不随给药剂量发生变化。（2）多次给药的血浆经时过程:多次给药后Beagle犬体内开、闭环及总银杏内酯A、B、K的消除半衰期和系统暴露量与单次给药相比均无显著性差异（p>0.05）,提示多次给药后银杏内酯A、B、K在Beagle犬体内的消除速度无明显变化,且不存在体内蓄积作用,说明在本研究所选择的剂量下用药安全,。4、银杏二萜内酯葡胺注射液体外代谢及药物相互作用研究本部分系统研究了银杏二萜内酯葡胺注射液的主要有效成分银杏内酯A、B、K的蛋白结合率、体外代谢情况及基于转运体和肝药酶的药物相互作用,研究结果如下:（1）银杏内酯A、B、K的血浆蛋白结合率考察:在选择的剂量范围内,银杏内酯A、B、K单独给药与混合给药的血浆蛋白结合率无显著性差异,说明三者之间无竞争性抑制;银杏内酯A、B、K在大鼠血浆中的蛋白结合率在26.5～53.0%之间,在Beagle犬血浆中的蛋白结合率在21.4～46.4%之间,在人血浆中的蛋白结合率在21.0～60.3%之间,均属于中等偏下程度的蛋白结合率,提示可能不会引起较明显的药物相互作用。（2）银杏内酯A、B的跨膜转运考察:采用HepG2、Caco-2细胞模型考察药物浓度、孵育时间和温度对银杏内酯A、B跨膜转运的影响。结果发现,在选择的浓度范围内,银杏内酯A、B的胞内量成浓度依赖性（r>0.9）,并能迅速达到平衡,其中银杏内酯B的跨膜转运不受温度影响,银杏内酯A受温度影响较大,提示可能与外排转运体间存在相互作用。（3）银杏内酯A、B的转运体相互作用考察:采用HepG2、Caco-2细胞模型评价银杏内酯A、B与P-gp的相互作用。结果表明,银杏内酯A、B均不是P-gp的抑制剂,且银杏内酯B不是P-gp的底物,银杏内酯A可能为P-gp的底物,但此结果需要进一步验证。（4）银杏内酯A、B、K体外代谢稳定性研究:分别考察了银杏内酯A、B、K在不同种属肝微粒体中的稳定性,并对其代谢产物进行分析。结果显示,银杏内酯A、B在不同种属的肝微粒体中相对稳定,银杏内酯K则稳定性差异较大,银杏内酯K在不同种属的肝微粒体中均检测到2个代谢产物,且稳定性存在一定的种属差异（5）银杏内酯A、B、K对人P450酶的抑制效应评价:采用肝微粒体孵育技术,评估银杏内酯A、B、K对6种常见的P450酶亚型的抑制作用。结果显示,银杏内酯A、B、K对6种代谢酶均无明显的抑制作用,提示发生药物相互作用的可能性较低。