[研究背景]骨缺损主要由创伤、感染或肿瘤切除手术引起,并呈逐年上升的趋势。如骨缺损超过一定范围,超过了骨骼的最大自行修复能力,则该骨缺损部位就无法自行愈合,从而导致无连续性骨痂形成,造成骨不连。此时,大多采用自体骨移植和同种异体骨移植治疗。据报道,全世界每年骨移植超过200万人次[1]。虽然自体骨和同种异体骨均具有天然的网状结构,能较好地解决了孔隙、孔径方面的问题,但两种骨移植方法均存在不同程度的缺陷[2-4]。因此,寻找理想的骨缺损替代修复材料是医学界关注的热点。骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）联合骨组织工程学支架为骨缺损治疗开辟了全新的途径。然而,外源性干细胞存在来源有限、潜在污染风险,以及疗效稳定性不佳和监管批准困难的问题[5]。因此,如何动员体内的内源性干细胞归巢来修复骨缺损是本领域研究的热点和难点。近年来,一些非接触式的微纳操控技术为骨组织工程支架体内募集内源性细胞提供了新思路[6-9]。其中,“声镊”技术可利用人工结构共振、干扰、散射形成声场来实现对被控对象的精确控制,其操控所需的功耗小,能产生较大的力进行粒子操控研究,且实验设备相对简单等优势,得到广泛关注。研究表明聚乳酸（Polylactic acid,PLA）材料的横波速小于水的纵波速,能够用在声辐射力作用下共振,形成声场形态用于声操控。此外,PLA声学支架的构建可借助三维（Three dimensional,3D）打印技术,建立与骨缺损相匹配的复杂外形,并能精确调控支架内部孔隙形态及大小,从而获得理想的骨修复材料[10-15]。因此,基于声辐射力的3D打印PLA多孔支架有望成为构建骨组织工程支架的新方法,为治疗骨缺损提供新思路。然而,3D打印PLA多孔支架借助声辐射力,仅能在支架附近形成局域声场的范围内实现其捕获细胞的功能。而在骨缺损形成后,自发迁移至该区域的干细胞数量有限,不足以修复较大的骨缺损,需要招募更多的内源性干细胞在骨缺损部位富集,才能实现更多细胞捕获及促骨修复[16]。根据骨修复的机制,骨修复的纤维血管期,基质细胞衍生因子-1（Stromal cell derived factor-1,SDF-1）和骨形态蛋白（Bone morphogenetic protein,BMPs）可趋化成骨修复的种子细胞——内源性BMSCs从骨髓及全身各处迁徙、募集至骨缺损部位。此外,在骨形成期,BMPs等关键促成骨分化因子的作用下,BMSCs向成骨细胞、成软骨细胞分化,最终通过软骨内成骨和膜内成骨形成骨骼。由此可见,SDF-1、BMP-2是参与骨修复的关键细胞因子,BMSCs是骨修复的的关键种子细胞。因此,本研究拟以骨修复机制为出发点,以3D打印PLA多孔支架作为声学材料,引入细胞因子——SDF-1和BMP-2,构建具备生物活性的仿生支架复合体。进一步研究仿生支架复合体借助超声动员内源性BMSCs及促骨缺损修复的疗效。第一章 3D打印聚乳酸（PLA）声学支架的制备及其捕获细胞性能的研究目的本章拟以PLA材料作为声学材料,采用3D打印制备PLA声学支架,探讨其能否实现在“声镊”技术操控下捕获BMSCs及其超声参数优化,为构建骨组织工程学支架奠定基础。方法1、构建3D打印PLA声学支架及测定其表征设计及采用3D打印技术制备PLA声学支架,并用扫描电镜检查观察其显微结构。测定PLA声学支架透射谱。利用comsol软件仿真其声场及声辐射力。2、正玄超声波（s-US）热效应的评估将3D打印PLA声学支架置于24孔板,并启动超声刺激。设置参数为1.5 MHz,正玄超声波（Sine ultrasound,s-US）,幅值分别为 60 mVpp、150 mVpp、200 mVpp,连续超声刺激20 min,每5 min利用Fluke热像仪测定并记录温度。3、骨髓间充质干细胞（BMSCs）的提取、培养及传代从4周雄性SD大鼠的股骨及胫骨提取原代骨髓间充质干细胞,并进行传代、冻存及复苏等操作。光学显微镜观察细胞形态。取第三代BMSCs进行细胞实验。4、s-US介导3D PLA声学支架体外捕获细胞能力的验证在光学显微镜下动态观察s-US介导促3D打印PLA声学支架体外捕获BMSCs情况。5、s-US介导BMSCs迁移实验构建仿腔并种植BMSCs,将圆盘支架置于腔室内,连续7天超声刺激（超声参数设置:s-US,频率1.5 MHz,幅值150 mVpp,持续作用2 min）处理后放置培养箱继续培养,并在光学显微镜下观察BMSCs迁移至支架情况。6、统计学处理采用社会科学统计软件包（Statisticalpackage for social science,SPSS）处理数据,数据以平均值±标准差（Mean±SD）表示,计量资料间比较确定方差齐性后,采用t检验,计数资料采用Mann-Whitney检验,P<0.05为显著性水准。结果1、3D PLA声学支架的表征:3D PLA声学支架呈圆盘,内部结构呈网格状,表面粗糙,测定其透射谱,显示其低阶共振频率在1.5 MHz。声场及声辐射力仿真结果示在超声共振频率（1.5 MHz）条件下,PLA声学支架表面形成声势梯度,故产生声辐射力促使支架周围的颗粒向支架移动。此外,随着支架周围颗粒粒径增大,支架表面的声辐射力呈数量级上升。2、s-US的热效应:采用s-US刺激3D PLA声学支架后,热效应引起的温度上升随着幅值的增加而增高（P=0.0064）。当采用超声幅值200mVpp时,s-US刺激后热效应引起的温度随着作用时间延长显著升高（P<0.0001）。3、BMSCs培养及其形态特点:提取原代SD大鼠骨髓间充质细胞培养过程中,约12小时细胞即可贴壁生长,换液后清楚显示细胞形态,呈圆形、梭形、三角形,生长缓慢,细胞分布不均匀。传代换液后BMSCs增殖明显,呈现以短梭形为主的多种形态,可出现细胞集落,10天左右80%可融合达到传代标准。第二代BMSCs形态也是呈短梭形为主的多种形态,细胞分布均匀。第三代BMSCs形态单一,呈长梭形型,部分细胞融合呈漩涡状或放射状排列。4、s-US介导3D打印PLA声学支架体外捕获BMSCs:光学显微镜下可见单根柱状PLA声学支架在共振频率（1.5 MHz）s-US刺激30 sec、60 sec、120 sec,捕获细胞数量均显著多于非共振频率组（1.4 MHz或1.6 MHz）（P30s=0.0014;P60s=0.0051;P120s=0.0365）。随超声时间延长,PLA声学支架在共振频率s-US刺激下捕获细胞数量也逐渐增加（N30s=25±9;N60s=69±31;N120s=120±84;P=0.2341）。进一步利用1.5 MHz s-US刺激3D打印的圆盘PLA声学支架共振,细胞向支架四边移动。测定该超声参数的声场强度为47 kPa。5、s-US介导3D打印PLA声学支架促BMSC迁移:以超声参数s-US,频率1.5 MHz,幅值150 mVpp,持续作用2 min/天,连续超声刺激7天后,可见大量BMSCs迁移至3D打印PLA声学支架支架表面,细胞呈三角形、梭形或椭圆形（Ns-Us（+）=99±20;Ns-US（-）=17±9;P（sUS（+）VSs-US（-）=0.0030）。结论1、3D PLA声学支架具有声学特性,其低阶共振频率为1.5 MHz,在超声作用下支架可共振产生局域声场,形成梯度声势。2、3D PLA声学支架在s-US介导及共振频率条件下可实现体外捕获BMSCs,且随超声作用时间延长,捕获细胞数量也相应增加;连续超声共振刺激可促进BMSCs迁移至支架表面。3、为达到最佳的细胞捕获效果的同时避免热损伤,s-US所采用的超声参数应可采用 150 mVpp、20 min。4、本章研究构建3D PLA声学支架,首次借助声辐射力以非接触方式实现体外捕获近处的BMSCs,为利用内源性BMSCs修复骨缺损开辟了新方法。第二章 3D打印聚乳酸（PLA）仿生支架复合体的制备及其招募干细胞归巢的体外研究目的在第一章中,我们成功构建了 3D PLA声学支架,可借“声镊”技术,通过非接触的方式捕获BMSCs。该支架只能实现近距离的细胞捕获。然而,为更好地实现骨缺损修复,需要招募更多远处的BMSCs至骨缺损部位富集。因此,本章研究将在3D打印PLA支架的基础上,从骨缺损修复机制出发,借助海藻酸钙水凝胶引入细胞因子——SDF-1及BMP-2,构建具备生物活性的骨组织工程学仿生支架复合体,探讨其在超声介导下释药参数优化及体外招募BMSCs归巢的能力。方法1、制备载异硫氰酸荧光素标记牛血清白蛋白（BSA-FITC）支架复合体及测定其表征、释药性能依次制备载载异硫氰酸荧光素标记牛血清白蛋白（Fluorescein isothiocyanate labeled serum albumin,BSA-FITC）海藻酸钙水凝胶及载BSA-FITC支架复合体。利用扫描电子显微镜观察其在脉冲超声波（Pulsedultrasound,p-US）刺激前后显微结构变化。进一步测定p-US刺激对载BSA-FITC海藻酸钙水凝胶及载BSA-FITC支架复合体释放药物的影响。优化p-US介导载BSA-FITC支架复合体释放药物的超声参数。2、脉冲超声波（p-US）热效应的评估将海藻酸钙水凝胶置于24孔板,并在孔板内加入1 ml PBS。将探头置于板底,并启动超声,参数为1.5 MHz,p-US,分别采用不同的占空比（10%、30%、50%、80%）及幅值（60mVpp、150mVpp、200mVpp）,连续超声刺激 20min,每5 min利用Fluke热像仪测定并记录温度。3、p-US介导海藻酸钙水凝胶体外降解的研究制备海藻酸钙水凝胶及体外测定其在p-US刺激下减重率变化。超声刺激参数如下:p-US模式,频率1.5 MHz,幅值150 mVpp,占空比50%,连续作用20 min/天。4、载SDF-1及BMP-2仿生支架复合体的制备及其释药研究制备载SDF-1及BMP-2仿生支架复合体,使得海藻酸钠终浓度70 mg/ml,CaSO4终浓度4 mg/ml,SDF-1和BMP-2终浓度均为3 μg/ml。每日采用p-US刺激该仿生支架复合体,并用Elisa法测定SDF-1及BMP-2释放量。超声参数设置:p-US模式,频率1.5 MHz,幅值150 mVpp,占空比50%,连续作用20 min/天。5、SDF-1及BMP-2促BMSCs体外分化能力验证取第三代BMSCs铺板后,各分为4个组进行诱导培养（空白对照组,SDF-1组,BMP-2组,SDF-1+BMP-2组）,分别在成骨诱导分化第4天进行碱性磷酸酶染色、取培养基进行碱性磷酸酶活性测定,以及成骨诱导分化2周进行茜红素染色,醋酸洗脱液利用酶标仪定量测定,并进行成脂诱导分化,2周后油红O染色。6、超声调控仿生支架复合体体外趋化BMSCs能力验证取第三代BMSCs铺板后,分为4个组:空白对照组、载SDF-1仿生支架复合体、载BMP-2仿生支架复合体、载SDF-1及BMP-2仿生支架复合体。各组分为2个亚组:超声组和非超声组。建立transwell模型,上室面种植BMSCs,下室内放置仿生支架复合体。在超声刺激后12小时,取出小室,固定染色细胞计数。超声参数设置:p-US模式,频率1.5 MHz,幅值150 mVpp,占空比50%,连续作用2 min/天。7、统计学处理采用社会科学统计软件包（Statistical package for social science,SPSS）处理数据,实验数据以平均值±标准差（Mean±SD）表示,计量资料间比较确定方差齐性后,采用t检验,计数资料采用Mann-Whitney检验,P<0.05为显著性差异的水准。结果1、载BSA-FITC支架复合体的表征扫描电子显微镜检查显示p-US促进载BSA-FITC支架复合体内水凝胶孔隙开放,且随着超声作用幅值增大及作用时间延长,载BSA-FITC支架复合体内水凝胶孔隙增大。2、p-US介导载BSA-FITC支架复合体释药钙离子浓度不变时,随海藻酸钠浓度增加,载BSA-FITC支架复合体白蛋白释放量下降;钙离子浓度在2mg/ml～4 mg/ml范围内时,随钙离子浓度增加,载BSA-FITC支架复合体内白蛋白释放量逐渐增多,并于钙离子浓度4 mg/ml时达高峰,之后释放量逐渐下降。p-US刺激载BSA-FITC海藻酸钙水凝胶与载BSA-FITC支架复合体的BSA-FITC累计释放量差异无统计学意义（P=0.8502）。p-US促进载BSA-FITC支架复合体内白蛋白释放。随着超声幅值增加、占空比增大及作用持续时间增长,载BSA-FITC支架复合体内白蛋白量在一定范围内释放增加。其中超声作用持续时间不同组间差异有统计学意义（P=0.0341）,p-US持续时间15 min后释放蛋白量接近最大,与无超声组差异有统计学意义（P=0.0428）。超声参数占空比50%,载BSA-FITC支架复合体内白蛋白量释放量达到最大。3、p-US的热效应采用p-US刺激后热效应引起的温度上升随着幅值及占空比增加、作用时间的延长而显著增高（P<0.0001）。其中,超声参数占空比50%且超声作用持续15min,随着超声幅值增加,超声产热显著提高（P<0.0001）。4、p-US介导海藻酸钙水凝胶的体外降解体外降解实验结果显示超声组海藻酸钙水凝胶降解率高于非超声组,差异有统计学意义（P=0.0005）。5、p-US介导仿生支架复合体释放SDF-1及BMP-2超声介导下载SDF-1及BMP-2仿生支架复合体的BMP-2及SDF-1每日释放量均高于非超声组,其中BMP-2释放差异存在统计学意义（P=0.0024）。6、SDF-1及BMP-2对BMSCs成骨分化、成脂分化的影响成骨诱导分化培养后,光学显微镜下显示BMSCs碱性磷酸酶染色阳性率及茜红素染色阳性率:SDF-1+BMP-2组>（BMP-2组、SDF-1组）>空白对照组。取其培养基进行碱性磷酸酶活性测定,结果显示SDF-1+BMP-2组显著高于对照组或SDF-1组（OD.SDF-1+BMP-2=0.45±0.02;OD.BMP-2=0.43±0.00;OD.SDF-1=0.42±0.01;OD.Control=0.41±0.01;PControlvs SDF-l+BMP-2=0.0064;PSDF-1 vs SDF-1+BMP-2=0.0147）。茜红素定量分析结果显示SDF-1+BMP-2组显著高于其余各组（OD.SDF-1+BMP-2=1.23±0.11;OD.BMP-2=1.09±0.06;OD.SDF-1=0.79±0.14;OD.Control=0.1 6±0.06;PControl vs SDF-l=0.0002;PControl vs BMP-2<0.0001;PControl vs SDF-1+BMP-2<0.000;PSDF-1 vs BMP-2=0.0245;PSDF-1 vs SDF-1+BMP-2=0.0025）。成脂诱导分化培养2周后,光学显微镜下显示BMSCs油红O染色阳性率:空白对照组>（SDF-1 组、BMP-2 组）>SDF-1+BMP-2 组。7、超声调控仿生支架复合体体外趋化BMSCs体外改良细胞迁移实验结果显示12小时各组细胞迁移数量差异有统计学意义（NControl=21±3;NSDF-1=150±8;NaMP-2=107±4;NSDSDF-1+BMP-2=301±7;P<0.0001）,且超声调控仿生支架复合体释放蛋白因子能进一步促进其细胞迁移C PControl=0.1662;PSDF-1=0.0102;PBMP-2=0.0022;PSDF-1+BMP-2=0.0024）。结论1、p-US介导海藻酸钙水凝胶内蛋白因子的释放,采用超声参数幅值150 mVpp,占空比50%,作用时间15 min为最有利于因子的释放且不产生致损性热效应。2、SDF-1联合BMP-2有助于促进BMSCs的迁移及成骨分化、抑制BMSCs成脂分化。3、p-US介导仿生支架复合体能在体外有效促进远处BMSCs的归巢。4、本章研究以PLA声学支架为基础,联合载SDF-1和BMP-2海藻酸钙水凝胶,构建具备生物活性的仿生支架复合体,并首次借助超声在体外介导其促远处的BMSCs归巢,弥补了 PLA声学支架捕获细胞距离受限的不足,为利用内源性BMSCs联合骨组织工程学支架修复骨缺损奠定了良好的基础。第三章 超声调控3D打印聚乳酸（PLA）仿生支架复合体介导内源性干细胞促骨修复的在体研究目的在前两章,我们已经成功构建了仿生支架复合体,并经体外实验验证其在超声介导下招募及捕获细胞效果。本章研究将进一步把仿生支架复合体植入动物体内,探讨其在超声介导下促骨缺损修复的疗效及生物安全性。方法1、p-US介导海藻酸钙水凝胶体内降解的研究制备载ICG海藻酸钙水凝胶,将载ICG海藻酸钙水凝胶植入大鼠皮下组织,超声组每天采用超声刺激水凝胶植入部位,并采用小动物活体成像仪观察及定量ICG荧光强度及面积。体内外降解实验超声刺激参数如下:p-US模式,频率1.5 MHz,幅值 150 mVpp,占空比 50%,连续作用 20 min/day。2、载SDF-1及BMP-2仿生支架复合体的制备制备载SDF-1及BMP-2仿生支架复合体,使得海藻酸钠终浓度70 mg/ml,CaSO4 终浓度 4mg/ml,SDF-1 和 BMP-2 终浓度均为 3μg/ml。3、超声调控仿生支架复合体体内趋化及捕获BMSCs能力验证分为 4 组:S+US（-）（支架组）、S+s-US（+）（支架+S-US 组）、SH+US（-）（仿生支架复合体组）、SH+p-US（+）（仿生支架复合体+p-US组）。各组治疗方案:S+US（-）:鼠股骨缺损造模后在骨缺损部位放置PLA支架,未采用超声治疗;S+s-US（+）:鼠股骨缺损造模后在骨缺损部位放置PLA支架,每日采用s-US刺激;SH+US（-）:鼠股骨缺损造模后在骨缺损部位放置仿生支架复合体,未采用超声治疗;SH+p-US（+）:鼠股骨缺损造模后在骨缺损部位放置仿生支架复合体,每日采用p-US刺激。s-US参数设置:频率1.5MHz,连续作用20 min/天。p-US参数设置:频率1.5 MHz,幅值150 mVpp,占空比50%,连续作用20 min/天。各组治疗一周后,取出支架置于24孔板内固定染色、显微镜下观察支架上迁移细胞情况及消化洗脱支架上的细胞进行BMSCs流式细胞鉴定。4、超声调控仿生支架复合体治疗大鼠股骨骨缺损疗效及安全性评估随机分为 6 组:SH、SH+p-US、SH+s-US、SH+p-US+s-US、S+p-US+s-US、SHAM组。各组治疗方案如下:SH:大鼠股骨缺损造模后在骨缺损部位放置仿生支架复合体,未采用超声辐照治疗;SH+p-US:大鼠股骨缺损造模后在骨缺损部位放置仿生支架复合体,前14天采用1.5 MHz p-US辐照;SH+s-US:大鼠股骨缺损造模后在骨缺损部位放置仿生支架复合体,14天后采用1.5 MHz s-US辐照,连续辐照14天;SH+p-US+s-US:大鼠股骨缺损造模后在骨缺损部位放置仿生支架复合体,前14天采用1.5 MHz p-US辐照,后14天采用1.5 MHz s-US辐照,连续辐照28天;S+p-US+s-US:大鼠股骨缺损造模后在骨缺损部位放置PLA支架,前14天采用1.5 MHz p-US辐照,后14天采用1.5 MHz s-US辐照,连续辐照28天;SHAM:大鼠股骨缺损造模后未在骨缺损部位放置材料以及采用超声辐照。p-US参数设置为:频率1.5 MHz,幅值:150 mVpp,占空比50%,作用持续时间:15 min;s-US参数设置为:1.5 MHz,幅值:150 mVpp,作用持续时间:20 min。建立大鼠股骨骨缺损模型后,采取相应治疗方案3个月后,采用Micro-CT（SkyScan 1176,Bruker,Madison,USA）测量股骨缺损部位的新骨形成进行并定量分析。Micro-CT检查后取大鼠股骨标本切片及HE染色、Masson三色染色,观察骨缺损部位修复情况及大鼠主要脏器切片HE染色观察主要脏器情况。5、统计学处理采用社会科学统计软件包（Statistical package for social science,SPSS）处理数据,实验数据以平均值±标准差（Mean±SD）表示,计量资料间比较确定方差齐性后,采用t检验,计数资料采用Mann-Whitney检验,P<0.05为显著性差异的水准。结果1、p-US介导海藻酸钙水凝胶的体内降解体外降解实验结果显示超声组海藻酸钙水凝胶降解率高于非超声组,差异有统计学意义（P=0.0005）。大鼠皮下植入海藻酸钙水凝胶后采用p-US刺激,超声组海藻酸钙水凝胶释放ICG面积显著高于非超声组（P=0.018）。测定ICG荧光强度间接反映海藻酸钙水凝胶的降解,结果显示超声组海藻酸钙水凝胶体内降解速度快于非超声组,超声刺激第12天超声组和非超声组平均荧光强度（Average radiant effeciency,ARE）分别为 ARFP-uS（+）=3.25±0.54×1 06（p/s）/（uW/cm2）、ARFP-us（-）=5.74±1.62× 106（p/s）/（uW/cm2）。2、超声调控仿生支架复合体体内趋化及捕获BMSCs大鼠体内骨缺损部位植入各组支架或仿生支架复合体一周后,取出支架,细胞固定后FITC染色显示,p-US介导仿生支架复合体募集细胞数量最多,支架联合s-US组次之,接着是仿生支架复合体组,其中单纯支架组募集细胞数量最少。进一步对招募细胞进行BMSCs鉴定,结果显示BMSCs比例分别为:S+US（-）0.37%;S+s-US（+）4.96%;SH+US（-）1.95%;SH+p-US（+）17.95%。3、超声调控仿生支架复合体修复大鼠股骨骨缺损的疗效评估治疗3个月后,各组大鼠股骨骨缺损部位进行CT三维重建,其中SH+p-US+s-US组修复效果最好,骨缺损部位几乎完全修复。定量分析各组成骨情况结果显示SH+p-US+s-US组的骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数目（Tb.N）、骨矿物质密度（BMD）显著高于其余各组（PBV/TV=0.0004;PTb.N=0.0403;PBMD=0.0014）,骨小梁分离（Tb.Sp）显著低于其余各组（PTb.Sp=0.0018）。大鼠股骨切片HE及Masson染色显示,与其他各组相比,SH+p-US+s-US组的大鼠股骨骨缺损部位可见大量新生骨形成,形成一层更厚的新生骨。4、超声调控仿生支架复合体修复大鼠股骨骨缺损的安全性评估组织学切片HE染色结果表明,各组别的主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺部、肾脏）均未见明显组织学形态及病理学改变。结论本章首次借助超声,成功实现了仿生支架复合体高效招募及捕获内源性BMSCs,并且安全、高效修复大鼠股骨骨缺损,为骨组织工程学支架介导内源性干细胞治疗骨缺损提供了新方法。