【摘 要】
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背景与目的:肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是最常见的肝癌类型,每年有约50%的死亡病例发生在中国,近年来,局部治疗、分子靶向治疗以及免疫治疗等综合治疗手段取得了一定进展,但肝癌的总体疗效仍不容乐观。长链非编码RNA（Long non-coding RNAs,LncRNAs）参与调控癌细胞的生物学行为,越来越受到关注。ADAMTS9是ADAMTS的家族成员之一,
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背景与目的:肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是最常见的肝癌类型,每年有约50%的死亡病例发生在中国,近年来,局部治疗、分子靶向治疗以及免疫治疗等综合治疗手段取得了一定进展,但肝癌的总体疗效仍不容乐观。长链非编码RNA（Long non-coding RNAs,LncRNAs）参与调控癌细胞的生物学行为,越来越受到关注。ADAMTS9是ADAMTS的家族成员之一,已经被证实在多种肿瘤中作为抑癌基因。LncRNA ADAMTS9-AS2是ADAMTS9的反义RNA,同时也与ADAMTS9是邻近基因。LncRNA ADAMTS9-AS2在肝细胞癌中的生物学功能和机制尚不明确。本研究探讨LncRNA ADAMTS9-AS2在HCC中的表达及其生物学功能和机制,为临床精准诊治提供新的潜在靶点。方法:1.检索UALCAN数据库中LncRNA ADAMTS9-AS2在HCC组织中的表达和生存曲线;RT-qPCR技术检测其在人肝癌细胞株（HepG2、MHCC97-H、Hep3B2.1-7、SMCC-7721）及正常人肝细胞株MIHA中的表达水平。2.选用 LncRNA ADAMTS9-AS2 低表达的 HCC 细胞株（HepG2、MHCC97-H）,采用CCK8细胞增殖计数实验、划痕愈合迁移实验和Transwell侵袭实验检测细胞生物学功能。3.Western Blot 检测 PI3K-AKT 通路关键蛋白 p-AKT、AKT、PIK3CB、p-mTOR和mTOR的表达,同时检测细胞自噬（LC3-Ⅰ/Ⅱ、BECN1和SQSTM1）和凋亡相关蛋白（Bax和Bcl-2）以及ADAMTS9的表达情况。运用生物信息预测筛选与LncRNAADAMTS9-AS2和ADAMTS9结合的miRNA,采用双荧光素酶报告基因实验、qPCR和Western blot方法,研究ceRNA调控机制。4.建立裸鼠体内移植瘤模型,观察LncRNAADAMTS9-AS2及与其结合的miRNA对裸鼠移植瘤生长的影响,RT-qPCR和Western blot方法检测移植肿瘤组织内PI3K-AKT通路关键蛋白、自噬和凋亡相关蛋白的表达情况。结果:1.通过检索UALCAN数据库,LncRNAADAMTS9-AS2在HCC组织中呈低表达;ADAMTS9-AS2表达上调时,亚洲人生存率明显获益。在HepG2和MHCC97-H细胞系中ADAMTS9-AS2呈显著低表达,其表达与ADAMTS9表达正相关。2.在 HepG2 和 MHCC97-H 这两个 HCC 细胞系中,LncRNA ADAMTS9-AS2表达上调抑制了 HCC细胞在体外的增殖、迁移和侵袭活性。3.在体外HCC细胞系中,上调LncRNA ADAMTS9-AS2表达,抑制PI3K/AKT/mTOR通路活性,促进自噬,诱导HCC细胞凋亡。通过生信预测筛选出 miR-93 和 miR-23b。miR-93 能与 LncRNAADAMTS9-AS2 以及 ADAMTS9结合,并下调LncRNA ADAMTS9-AS2以及ADAMTS9的表达。RT-qPCR和Western blot 检测发现 miR-93 过表达时,LncRNA ADAMTS9-AS2 及 ADAMTS9的表达均显著下调。同时过表达miR-93和ADAMTS9-AS2时,相对于仅上调LncRNAADAMTS9-AS2,ADAMTS9 的表达显著下调。4.成功构建裸鼠体内HCC移植瘤模型,相对于空白对照组,过表达ADAMTS9-AS2组瘤体增长慢、最小;过表达miR-93组瘤体最大、生长最快;同时过表达ADAMTS9-AS2和miR-93时,瘤体增长速度较对照组慢,较ADAMTS9-AS2组快。裸鼠移植瘤体内LncRNA ADAMTS9-AS2上调,抑制PI3K-AKT通路的活化,促进细胞的自噬与凋亡,而miR-93作用恰好相反。结论:LncRNAADAMTS9-AS2可通过表达上调抑制PI3K-AKT通路活性,同时通过ceRNA机制与miR-93竞争上调ADAMTS9表达,促进HCC细胞自噬和凋亡,抑制HCC的增殖、迁移和侵袭。LncRNA ADAMTS9-AS2在HCC中发挥抑癌基因的作用,可能成为HCC的精确诊断的潜在生物标志物和治疗的靶标。
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