果实甜度是柑桔、苹果等水果的重要品质之一,它由糖、酸含量以及糖酸比决定。其中有机酸（主要是柠檬酸和苹果酸）含量是决定果实甜度或糖酸比等风味品质的一个重要指标,再者增加果实糖含量会导致果实货架期的缩短,因此调节酸度以提高果实品质已经成为园艺研究和育种的主要目标之一。果实有机酸的含量与果实类型、基因型、果实发育等因素有关,并受环境条件和栽培管理方式的影响。一般果实有机酸在果实生长发育过程中逐渐积累,在果实成熟过程中逐渐被消耗。因此,果实中有机酸的最终含量取决于合成和降解之间的平衡。目前国内外关于果实中酸度调控机理的研究主要在柠檬酸和苹果酸的合成、转运、贮存和降解等方面。本实验室前期充分利用中国农科院柑桔研究所国家柑桔种质库中四个不同酸度品种的甜橙,运用RNA测序技术对幼果期和膨大后期的基因表达谱进行了整合性的系统生物学研究,并构建酸度调控基因共表达网络。通过分析基因网络,筛选出了15个与酸度调节最相关的基因,这些基因很可能起转运蛋白、转录因子、细胞信号转导、细胞逆境应答等作用。在此基础上,本研究首先对影响甜度的另外两个因素（糖含量和糖酸比）分别进行了类似的系统生物学研究,期望通过甜橙果实早期发育过程中糖积累相关的基因共表达网络和糖酸比基因共表达网络的构建,筛选出关键候选基因。同时,对酸度调控网络中的3个枢纽（Hub）基因CsAIL6、CsAHA10、CsTT8进行基因表达载体的构建和锦橙的遗传转化,并利用转基因草莓加速进行了其中一个基因（FvAIL6）在果实酸度方面的生理功能验证。主要结果总结如下:1.甜橙果实糖酸比相关基因的系统生物学分析。尽管果实糖酸比能否作为一个单独性状仍有争议,但是糖酸比是影响甜度的一个重要指标。本研究分别比较了与糖、酸、糖酸比相关的基因,以期分离出那些特异影响糖酸比的枢纽基因。对4个不同品种甜橙果实在两个生长发育阶段的糖、酸含量以及糖酸比的分析结果显示,花后45天,糖、酸含量以及糖酸比差异不大。但是花后142天,由于4个不同品种甜橙果实糖含量均明显增加,导致花后142天果实的糖酸比与酸度变化不尽相似:新会橙几乎不变;纽荷尔脐橙略微增加;冰糖橙和埃及糖橙显著增加。为了筛选甜橙果实糖酸比相关的候选基因,本研究对花后45天和花后142天有表达差异的7,430个基因进行糖酸比相关性分析。最终筛选出的72个与糖酸比强烈相关的候选基因,构建和分析了基于糖酸比基因模块的子网络,并对其中的枢纽基因进行了相关性分析。但是韦恩图分析和基因共表达模块分析结果显示只有极少数糖酸比相关基因与酸度或糖含量相关,据此推测至少在这四个甜橙中很可能存在一种独立于糖和酸度之外、可以调控果实糖酸比的基因表达机制。2.果实发育早期糖积累过程的基因共表达网络研究。基于本实验室前期甜橙果实发育和糖、酸积累的研究结果,本研究发现从花后45到142天的过程中,四个品种的果实尽管酸度变化不同但糖含量均显著增加。因此,本研究着重分析这四个品种的果实在这一发育阶段共同的基因表达谱,以期发现一些在果实膨大期与糖积累相关的共性基因。为此,本研究分析了3,145个在4个不同品种甜橙果实都显示差异表达的基因,并分别构建了赤霉素响应、乙烯响应、转录因子、染色质修饰基因共表达的子网络,并对其中枢纽基因的生理功能进行了预测。赤霉素响应子网络结果显示,细胞分裂和细胞骨架组织是最具有显著富集的GO术语。这与赤霉素能够调节细胞分裂,细胞膨大和细胞骨架作用相一致。乙烯响应子网络结果显示乙烯响应因子（例如ERF13）以及其他乙烯响应基因（例如ALP和MYB14）在甜橙果实发育早期糖积累过程中可能具有十分重要的作用。本研究对257个转录因子的韦恩图分析结果显示,这些转录因子广泛参与初级代谢调控、发育进程和激素响应等生理进程。此外,还构建了染色质修饰子网络,结果显示其中有4个基因与发育调节、代谢调节和激素响应有关。3.甜橙果实酸度调控枢纽基因CsAIL6、CsAHA10、CsTT8的表达分析、生物信息学分析以及遗传转化。CsAIL6基因编码一个由532个氨基酸构成的转录因子,属于AP2/ERF基因家族AP2亚家族,氨基酸序列进化树分析结果显示,CsAIL6与拟南芥AtAIL6、AtAIL7高度同源,果实基因表达分析结果预示CsAIL6基因对酸度很可能具有负调控作用。CsAHA10（Cs1g16150）又名CitPH5或CsPH8,该基因编码952个氨基酸,属于P-ATPase基因家族。其蛋白产物系统进化树分析显示,在柑桔中该基因有一个与之高度同源（77%）的基因Cs1g16160,它们是拟南芥AtAHA10以及矮牵牛PhPH5直系同源蛋白。有研究表明CsAHA10定位于液泡膜,其在高、低酸柠檬品种中的表达受CsTT8或其他上游因子调控。CsTT8又名CitAN1,编码一个含692个氨基酸的转录因子。氨基酸序列进化树分析显示,CsTT8与目前已经报道的在其它植物中编码与类黄酮合成相关的bHLH转录因子（如拟南芥AtTT8、矮牵牛PhAN1、玉米ZmR）等属于直系同源关系,都属于bHLH家族Ⅲf亚家族。CsTT8除了能够调控CsAHA10和CsECA4编码的H+-ATPase外,还与MYB转录因子及WD40蛋白构成MBW复合体调控类黄酮代谢,从而导致液泡pH值和植物花色的改变。本研究对上述三个基因（CsAIL6、CsAHA10、CsTT8）进行了锦橙的遗传转化。分别构建了基因编辑载体、过表达载体和RNA干扰载体,目前已获得过表达植株35株,RNA干扰植株75株。由于上述三个基因具有组织特异性表达的特性。同时,因为甜橙童期较长,到目前为止转基因甜橙植株仍未开花结果。因此无法对转基因甜橙中的基因表达效果进行鉴定、筛选,更无从对果实的酸度进行评估。4.FvAIL6对草莓果实酸度控制的基因功能验证。二倍体草莓相较柑桔而言具有童期极短、果实发育过程快等优势。而且草莓与柑桔具有相同的生长发育过程,均为柠檬酸型果实,同属非呼吸跃变型植物。因此,虽然柑桔与草莓的食用部位不同,但是在本实验室先前用草莓进行的基因表达研究中发现,草莓和甜橙具有相似的与酸度积累相关的基因表达模式。基于这些因素,本研究选择AIL6在二倍体草莓（Fragaria vesca L.Yellow Wonder 5AF7）中进行基因功能的加速验证。FvAIL6基因的器官表达特异性分析结果预示FvAIL6基因对草莓花、根和果实发育有影响。本研究对FvAIL6的RNA干扰载体进行了草莓的遗传转化实验,先后共获得转基因植株23株。先期的qRT-PCR结果显示,共有三个独立株系（CZ46-3,CZ46-31和CZ46-68）其FvAIL6内源基因在花中的表达量降低了30%～55%。本研究对最早获得的CZ46-3转基因植株花后17天果实测酸结果显示,与非转基因的野生型相比,CZ46-3果实酸含量增加了38%。进一步对CZ46-3植株花后7天（幼果期）、17天（膨大期）、27天（成熟期）的草莓果实进行了酸含量测定。结果显示花后17天,CZ46-3果实较野生型酸含量增加了38%,表明酸度结果可靠。令人感兴趣的结果是不同于野生型果实从7天到17天,酸含量急剧增高,CZ46-3果实的酸含量基本维持在高水平:在花后7天,其果实较野生型酸含量增加了2.6倍;花后27天,仍比野生型略高（13%）。这一结果表明,FvAIL6作为柑桔CsAIL6的直系同源基因,很可能是一个果实酸度的负调控因子,这也表明二倍体草莓作为一种果实模型可以用于研究柑桔等童期较长的果实中基因的生理功能。综上所述,本研究从三个方面对果实甜度控制的机理进行探索性或验证性的研究,即利用系统生物学构建了果实糖酸比和膨大期糖积累相关的基因共表达网络,同时对本实验室前期筛选的酸度调控基因网络中的三个关键枢纽基因通过转基因手段进行功能验证。尽管转基因甜橙的长童期阻碍了这三个基因的功能验证,但是本研究发现FvAIL6转基因二倍体草莓果实的酸度有显著增加。这一创新性的发现表明FvAIL6具有负调控酸度的生理功能,同样重要的是,这也证明了本实验室之前构建的甜橙果实酸度基因共表达网络的可靠性,说明利用系统生物学筛选关键枢纽基因、并结合反向遗传学进行功能验证这一研究策略的有效性,这为今后从糖、酸及糖酸比这三个方面研究果实甜度控制的分子机理开创新的方向。