【摘 要】
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体细胞核移植技术不仅可以挽救濒危物种,且在农业和医学领域具有重要的应用价值。但是,克隆效率低下一直制约着克隆技术的发展。研究表明,克隆胚胎中Xist基因异常高表达,且X染色体的失活和Xist基因密切相关。在小鼠克隆胚胎中敲除Xist基因或者利用RNA干扰（RNAi）技术抑制Xist基因表达,且RNAi技术联合组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）,小鼠克隆效率均显著提高。本实验室前期研究发现在猪克隆
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体细胞核移植技术不仅可以挽救濒危物种,且在农业和医学领域具有重要的应用价值。但是,克隆效率低下一直制约着克隆技术的发展。研究表明,克隆胚胎中Xist基因异常高表达,且X染色体的失活和Xist基因密切相关。在小鼠克隆胚胎中敲除Xist基因或者利用RNA干扰（RNAi）技术抑制Xist基因表达,且RNAi技术联合组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）,小鼠克隆效率均显著提高。本实验室前期研究发现在猪克隆胚胎1-细胞期注射siRNA,结果表示小幅度提高了猪克隆胚胎发育效率。抑制猪Xist基因能否大幅度提高猪克隆胚胎发育效率仍不是非常确定;抑制猪Xist基因联合HDACi处理克隆胚胎,能否提高猪克隆胚胎发育效率且有叠加效果目前仍没有报道。本实验比较了基于siRNA和基于sh RNA表达载体的两种不同RNAi方法对公猪克隆胚胎的Xist基因表达、X染色体连锁基因表达以及发育效率的影响,筛选出了更有利于抑制公猪克隆胚胎Xist基因表达的sh RNA干扰方法,然后在猪克隆胚胎中通过sh RNA或基因敲除抑制Xist基因表达,同时通过药物处理克隆胚胎抑制组蛋白去乙酰化,比较两种处理在单独及联合情况下对猪克隆胚胎发育效率及基因表达模式的影响。实验结果如下:（1）雄性猪克隆2-细胞期注射siRNA,在囊胚期无法抑制克隆胚胎Xist基因表达以及挽救X染色体失活;（2）雄性猪克隆2-细胞期注射sh RNA,猪克隆胚胎平均囊胚细胞数差异显著,其中浓度5 ng/μl的sh RNA囊胚率接近显著水平,在囊胚期能够抑制克隆胚胎Xist基因表达以及挽救X染色体失活;（3）有利于提高猪克隆胚胎体外发育效率的最佳联合处理方法是敲除猪Xist基因并联合LAQ824药物抑制组蛋白去乙酰化。以上结果表明,基于siRNA干扰方式在囊胚期无法抑制克隆胚胎Xist基因表达以及挽救X染色体失活,注射sh RNA表达载体干扰方式在囊胚期能够抑制克隆胚胎Xist基因表达以及挽救X染色体失活。基于抑制Xist基因表达联合HDACi的处理方法有利于提高猪克隆胚胎体外发育效率。
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