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红曲菌(Monascus spp.)属于食品发酵微生物,其发酵产品红曲,在我国有近2000年的应用历史。红曲色素(Monascus pigments,MPs)是红曲菌产生的天然色素,主要用做食品着色剂。由于具有天然、安全等特性,是近年来我国发展速度最快的食品着色剂之一。关于MPs合成途径的研究开始于上世纪60年代初,但目前仍不清楚。从上世纪90年代中期开始,本实验团队开展了红曲菌分子生物学研究,于2010年完成1株红色红曲菌(M M7的全基因组测序与分析,克隆得到一个全长为51 kb,包括16个基因的合成MPs的基因簇,并对相关基因陆续开展了研究。本实验对MPs合成基因簇中的MpigM和MpigN/O基因的功能进行了初步研究。通过根癌农杆菌介导的转化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT)方法,对该基因簇中MpigM和MpigN/O分别进行了敲除,得到突变菌株△MpigM和△MpigN/O,并对其生长、色素与桔霉素产生等进行了分析。具体结果如下:1.MpigM和MpigN/O的敲除以潮霉素B抗性基因(hph)为筛选标记,分别与基因MpigM和MpigN/O的上下游序列构建敲除载体pCMPIGM和pCMPIGN/O,采用ATMT,对M ruber M7进行了转化,通过PCR和Southern blot对获得的转化子进行筛选验证,分离得到阳性敲除子△MpigM 和△MpigN/O。2.△MpigM和△MpigN/O的特性分析2.1 △MpigM和△MpigN/O在不同培养基上的生长特点将基因敲除菌株△MMpigM和△pigN/O与野生出发菌株M7分别点接于研究红曲菌常用的土豆葡萄糖固体培养基(Potato dextrose agarmedium,PDA)、甘油硝酸盐琼脂培养基(Glycerol(25%)nitrate agar medium,G25N)、察氏酵母提取物琼脂培养基(Czapek yeast extract agar medium,CYA)平板上,28℃培养,10 d,观察菌落和显微形态。结果显示,在以上各种培养基上△MpigM菌落的颜色均比M7的浅,而△MpigN/O的菌落则观察不到颜色。在生长速度方面,在以上各种培养基上,△MpigM的菌落直径与M7的没有明显区别。在PDA培养基上,△MpigN/O的菌落直径与M7差别不明显,而在CYA以及G25N培养基上,△MpigN/O的菌落直径约为M7的70%。显微观察发现,△MpigM和M7在PDA培养基上既可以产生分生孢子又可以产生闭囊壳,而△MpigN/O在PDA上只能观察到分生孢子,没有闭囊壳。M7在CYA和G25N培养基上主要产生大量分生孢子,△MpigM和△MpigN/O的观察结果与M7一致。以上结果表明,基因MpigM和MpigN/O都对菌株色素的产生有显著影响。MpigM的缺失对生长速度以及有性/无性繁殖无影响,而MpigN/O的缺失会减缓菌落的生长速度,影响菌株的有性繁殖,推测MpigN/O还是一个调控基因,可能参与MPs合成之外的其他过程,或是基因敲除的过程中产生了多拷贝菌株,使其他基因失活。2.2生物量的比较分别将M ruber M7和基因敲除菌株△MpigM和△MpigN/O的孢子悬液接种到土豆葡萄糖液体培养基(PDB)中,在28℃,100 r/min培养15 d,每隔2d取一次样,过滤分离发酵液和菌丝体,称量干燥后的菌丝体的重量,根据不同时间的发酵样品中菌丝体的干重,分析菌株液态发酵过程中生物量的变化。结果发现,△MpigM和△MpigN/O的生物量变化趋势与M7的相似,但M7的最大生物量可以达到4.7 mg/mL,而△MpigM和△MpigN/O的最大生物量分别为4.3 mg/mL和3.4 mg/mL。以上结果再次证明,基因MpigM对生长基本无影响,而基因MpigN/O除影响MPs合成外,还会影响菌株生长。2.3 △MpigM和△MpigN/O的MPs 成分分析分别将M7和△MpigM和△MpigN/O的孢子悬液接种到PDB培养基中,在28℃,100 r/min培养12 d,通过HPLC分别对发酵液和菌丝体的色素成分进行分析。结果显示,△MpigM的MPs成分中检测不到野生型菌株M7通常产生的几种MPs成分,主要只产生了四种黄色素,对其中含量较多的两种物质,经LC-MS等分析。结合相关研究报道,推断出这两种物质为Monasfluol A和Monasfluol B。而△MpigN/O的发酵液和菌丝体中没有发现MPs成分,但可以检测到MPs合成前体物M7pks-1。根据上述分析结果初步推断:MpigM编码的蛋白可能催化MPs结构中呋喃环的形成,而MpigN/O编码的蛋白可能负责化合物M7pks-1中吡喃环闭合。2.4 △MpigM和△MpigN/O产桔霉素能力分析分别将M M7和基因敲除菌株△MpigM和△MpigN/O的孢子悬液接种到PDB培养基中,在28℃,100 r/min培养15 d,每隔2d取一次样,过滤分离发酵液和菌丝体,通过HPLC分别对发酵液和菌丝体中桔霉素的含量进行分析,结果显示,M7与△MpigM发酵液中桔霉素的含量在15 d内逐渐升高,并在第15 d达到最大值,分别为89.3μg/mL和64.2 μg/mL,而M7与△MpigM菌丝体内桔霉素的含量在第9d达到最大值,分别为6.3μg/mL和9.5μg/mL,而△MpigN/O桔霉素产量与M7相比显著降低,低于本实验条件下桔霉素标准曲线中标准品的最低浓度0.5μg/mL。根据上述结果推测:红曲菌产生MPs和桔霉素的过程相互影响的,但是影响机理有待探讨。