研究背景和目的流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE,简称乙脑)也称日本脑炎,是由流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV,简称乙脑病毒)引起,经蚊传播的人畜共患的中枢神经系统急性传染病。乙脑的病死率高达20%～30%,30%～50%存活者患有神经系统后遗症,仅25%存活者最终能够完全康复,乙脑给社会和家庭带来了巨大的疾病负担。乙脑病毒属于黄病毒科黄病毒属,为单股正链RNA病毒,大小约为11kb,含有一个长的开放阅读框架(open reading frame,ORF),其ORF编码3个结构蛋白(C蛋白、PrM/M蛋白、E蛋白)和7个非结构蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5)。乙脑病毒一共分为五个基因型(GⅠ、GⅡ、GⅢ、GⅣ和GⅤ)。GⅠ型乙脑病毒主要分布在印度、澳大利亚、韩国、日本和东南亚地区;GⅡ型分布在韩国、泰国、印度尼西亚、马来西亚、澳大利亚和巴布亚新几内亚;GⅢ型分布在印度尼西亚、马来西亚、斯里兰卡、尼泊尔、韩国、日本和中国;GⅣ型主要分布在印度;GV分布在新加坡、马来西亚和中国。最新的进化发育分析发现近年在亚洲,如中国、泰国、韩国、日本、马来西亚、越南、泰国等,存在GⅠ取代GⅢ成为亚洲主要流行株的趋势。乙脑流行于亚洲东部、南部及太平洋沿岸,全球每年大约有67900例报告病例,其中约33900(50%)例发生在中国(中国台湾除外);近51000(75%)例患者为0～14岁的儿童(发病率5.4/100000)。我国是乙脑高发地区之一,全国除了青海以外的省、直辖市、自治区均有乙脑病例的报道,局部地区有暴发或者流行。我国乙脑高流行区(发病率>0.5/100000)包括河南、重庆、四川、贵州及云南,尽管其人口只占全国人口的26%,但50%以上的乙脑病例来自这些地区。中流行区(发病率为0.2/100000～0.5/100000)包括陕西、安徽、湖北、湖南、江西及广西省。其他省份(不包括青海)均为低流行区(发病率<0.2/100000)。已知猪是乙脑病毒主要的动物储存和扩散宿主。除猪以外,有些动物也被认为是乙脑病毒的宿主,其中包括蝙蝠。蝙蝠被认为是重要的病毒储存宿主,迄今为止已在蝙蝠体内分离出80多种病毒,例如冠状病毒、亨德拉病毒、埃博拉病毒,其中也包括乙脑病毒。中国和日本的研究表明在蝙蝠体内能检测到乙脑病毒或乙脑病毒的血清抗体。近二十年来,中国云南省的4株乙脑病毒蝙蝠分离株(B58、GB30、HB49和HN97)及本课题组分离出的广东、湖南及海南乙脑病毒蝙蝠分离株(GD1、HN2、YY87和YY158)的基因组序列已被确认,这8株乙脑病毒蝙蝠分离株均属于GⅢ型。然而,目前中国大陆主要流行的乙脑病毒株为GⅠ型。蝙蝠在乙脑传播环节中的作用尚不清楚。为了进一步探讨蝙蝠在乙脑病毒传播中的作用,我们在广东省和海南省部分地区收集蝙蝠标本,了解蝙蝠乙脑病毒携带率及血清抗体阳性率情况。研究方法1.蝙蝠标本的收集与处理2013年6月至2013年11月期间,在广东和海南省部分地区收集蝙蝠标本,进行编号后请广州大学生命科学院蝙蝠研究专家吴毅教授和海南师范大学生命科学院陈忠教授进行种类鉴定。蝙蝠收集地点主要为野外阴湿的山洞。蝙蝠乙醚麻醉,心脏采血后无菌解剖,取脑组织标本,保存在含有RNAlater的冻存管中,与血样一起置于密封的冰袋泡沫盒中,12 h内运输回实验室,放入-80℃冰箱保存,待检测。2.蝙蝠血清乙脑抗体的检测蝙蝠血液离心后取血清,用间接ELISA法检测蝙蝠血清中的乙脑病毒抗体。3.蝙蝠脑组织乙脑病毒的检测首先用Roche High Pure Viral RNA Kit提取蝙蝠脑组织RNA病毒核酸,然后用Roche Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit进行逆转录合成cDNA,之后以逆转录产物cDNA为模板,利用TaqMan Real-time PCR法检测乙脑病毒。4.蝙蝠乙脑病毒株的分离单层BHK-21细胞分别接种5份TaqMan Real-time PCR检测蝙蝠乙脑病毒阳性标本(HK21、GD189、GD190、GD219、GD220),并设乙脑病毒Nakayama株为阳性对照,正常细胞为空白对照。持续观察7天,7天后收取细胞病毒液,于-80℃冰箱中冻存。期间,若细胞形态出现明显变化,如细胞圆缩、颗粒增多、融合或碎裂死亡判断为阳性,阳性标本做分子生物学检测及进一步培养分离;未观察到细胞形态变化者,利用TaqMan Real-time PCR检测是否有病毒增殖。连续盲传三代,若细胞形态仍无变化,且TaqMan Real-time PCR检测结果为阴性,则判断为阴性。每组5只2～3日龄NIH乳鼠,分别经颅接种0.02ml TaqMan Real-time PCR检测乙脑病毒阳性的标本(HK21、GD189、GD190、GD219、GD220)研磨液,设Nakayama株为阳性对照,阴性对照接种等量的DEPC水。观察记录乳鼠是否出现拒乳、弓背、行动迟缓、侧卧、抽搐、嗜睡、偏瘫等乙脑病毒感染的典型症状以及死亡情况。接种后24h内每2h观察1次,24h后一天观察3次。濒死乳鼠行无菌操作解剖取脑组织,保存于RNA later,置于-80℃冰箱用于检测;观察期为两周,若无症状出现,则连续盲传三代,如仍未出现发病症状,且经检测后为阴性,则判断为阴性。5.蝙蝠乙脑病毒株的鉴定将染毒BHK-21细胞悬液和染毒乳鼠脑组织进行RNA提取、逆转录、RT-PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、TaqMan Real-time PCR,阳性PCR产物送公司测全序。6.质量控制(1)冻存管、移液枪头、EP管等实验耗材均为一次性用品;(2)RNA的提取、TaqMan Real-time PCR反应体系的试剂加样均在生物安全柜进行操作,防止环境中RNA酶的污染;(3)细胞培养过程中所有操作均在细胞培养间超净台内进行操作,防止污染;(4)全程戴口罩、手套及帽子,防止试剂和实验过程受到污染;(5)实验过程严格设立阴、阳性对照及空白对照;(6)RNA提取和逆转录cDNA所用容器和配制试剂均用DEPC水处理,高温高压处理,烘干待用,防止RNA酶的污染。研究结果1.蝙蝠标本的基本情况本次研究在广东和海南地区共收集蝙蝠343只,包括蝙蝠科(Vespertilionidae)、菊头蝠科(Rhinolophidae)和狐蝠科(Pteropodidae)3个科,分别为普通伏翼蝠(Pipistruells abramus)、普通长翼蝠(Miniopterus schreibersi)、中华菊头蝠(Rhinolophus sinicus)、小菊头蝠(Rhinolophus blythi)、棕果蝠(Rousettus leschenaultia)以及大耳菊头蝠(Rhinolophus macrotis)6 种蝙蝠。2.蝙蝠血清乙脑抗体的检测结果在收集到的201份蝙蝠血清样品中,147份来自广东,54份来自海南。广东收集的147份血清样本中45份呈现乙脑抗体阳性,阳性率为30.61%,其中检测普通伏翼蝠132只,41只抗体阳性,抗体阳性率为31.06%;检测棕果蝠13只,4只阳性,阳性率为30.77%;小菊头蝠和大耳菊头蝠各检测1只,抗体均为阴性。海南收集的54份血清样本中48份呈现乙脑抗体阳性,阳性率为88.89%,其中检测45只普通长翼蝠,43份呈现乙脑抗体阳性,抗体阳性率高达95.56%;检测棕果蝠8只,4只抗体阳性;检测大耳菊头蝠1只,为抗体阳性。3.TaqMan Real-time PCR法检测蝙蝠脑组织乙脑病毒结果利用TaqMan Real-time PCR方法对收集的343份蝙蝠脑组织标本进行了乙脑病毒检测,结果检测出弱阳性5份,其中广东4份,阳性率1.62%(4/247),海南1份,阳性率1.06%(1/96)。乙脑病毒检出于两种蝙蝠,分别为普通长翼蝠和普通伏翼蝠。4.蝙蝠乙脑病毒株的分离及鉴定结果细胞接种TaqMan Real-time PCR检测为乙脑病毒阳性的蝙蝠标本研磨液之后有部分变圆脱落,但是病变没有阳性对照明显,盲传三代后无明显病变,且细胞病毒悬液TaqMan Real-time PCR检测结果为乙脑病毒阴性。阳性对照细胞从第二天开始出现病变,细胞陆续变圆脱落。空白对照BHK-21细胞一直呈梭形生长。在接种蝙蝠标本的乳鼠脑组织中没有检测到阳性TaqMan Real-time PCR产物。5份标本接种乳鼠未观察到乙脑病毒感染的典型症状。阳性对照组乳鼠2～5日内出现拒乳、颈项强直、弓背、行动迟缓、侧卧、抽搐、偏瘫等症状。阴性对照组没有出现病变,观察14天后仍健康。5.TaqMan Real-time PCR检测为乙脑病毒阳性的3只蝙蝠,其血清乙脑病毒抗体也为阳性。研究结论1.采用TaqMan Real-time PCR方法对广东省和海南省部分地区的蝙蝠携带乙脑病毒的情况进行调查,发现普通长翼蝠和普通伏翼蝠体内携带乙脑病毒,说明在自然条件下,我国某些地区的某些蝙蝠种类体内存在乙脑病毒,但病毒载量较低,其在乙脑病毒的传播过程中的作用仍需进一步探讨。2.广东省的普通伏翼蝠、棕果蝠和海南省的普通长翼蝠均存在较高的乙脑血清抗体阳性率,提示这些种类的蝙蝠对乙脑病毒的易感性很高,参与自然界中乙脑病毒的循环。