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毕赤酵母（Pichia pastoris）是当前应用较为广泛的真核表达系统,因其具有高效调节的甲醇诱导型启动子(PAOX1),能够严格调控酵母外源蛋白的表达分泌。目前,毕赤酵母已成为生产外源蛋白的重要工具,在医药、食品和饲料等领域发挥着重要作用。但由于不同外源蛋白的表达量差异较大,外源蛋白表达缺乏有效的调控机制,尤其在信号传导通路调控蛋白分泌方面知之甚少,因此,如何进一步改造底盘细胞毕赤酵母,提高目的蛋白表达效率,是当前亟需解决的问题。基于该现状,本实验以高表达植酸酶的毕赤酵母GS115/p PIC9K-Phy A为出发菌株,结合实验前期RNA-Seq分析技术,获得毕赤酵母甲醇诱导期明显上调基因,这些基因主要发生在自噬（Autophagy）通路及MAPK（Mitogen-activated protein kinase）通路中。自噬通路在酵母细胞应对外界刺激,如饥饿或生长因子缺乏等刺激下,对维持细胞内环境稳态具有重要作用,是酵母细胞生长代谢的重要调控通路。MAPK通路对酵母细胞生长、细胞壁合成以及细胞响应外界刺激等过程起着重要调控作用。自噬和MAPK通路可能通过影响细胞生长代谢和相关通路激酶进一步刺激PAOX1,进而影响蛋白的分泌表达。植酸酶是一种重要的工业用酶,可以通过毕赤酵母进行发酵表达。植酸酶能够水解植酸磷,不仅能提高畜禽对磷的利用率,促进畜禽的生长发育、代谢繁殖,而且减少了环境中植酸磷排放的污染。因此,优化毕赤酵母表达系统,利用毕赤酵母实现植酸酶的高效生产,对植酸酶的工业化应用有重要意义。本研究利用实验室前期构建的CRISPR/Cas9高效编辑系统,对自噬及MAPK通路中关键上调基因进行敲除,探究缺失基因对毕赤酵母生长代谢及外源蛋白表达的影响。本研究获得成果如下:自噬信号通路:（1）利用CRISPR/Cas9编辑系统,成功构建7个自噬通路基因缺失型菌株:ΔPAS＿chr2-1＿0641、ΔPAS＿chr3＿0964、ΔPAS＿chr1-4＿0339、ΔPAS＿chr4＿0704、ΔPAS＿chr1-1＿0353、ΔPAS＿chr1-4＿0555、ΔPAS＿chr1-1＿0097。（2）测定基因缺失型菌株在葡萄糖（YNA）、甘油（YNG）及甲醇（YNM）三种不同碳源培养基中的生长情况。结果显示,PAS＿chr3＿0964、PAS＿chr1-4＿0555、PAS＿chr1-1＿0097基因的缺失促进了菌株在甘油中的生长;PAS＿chr2-1＿0641、PAS＿chr3＿0964、PAS＿chr1-1＿0353基因的缺失在甲醇代谢后期促进了细胞对甲醇的利用;PAS＿chr1-1＿0097基因的缺失抑制了菌株对葡萄糖的利用。（3）比较缺失型菌株与野生型菌株植酸酶的表达差异。结果显示,PAS＿chr2-1＿0641、PAS＿chr4＿0704、PAS＿chr1-1＿0353、PAS＿chr1-4＿0555基因的缺失使毕赤酵母植酸酶表达量有所提高。其中,PAS＿chr2-1＿0641缺失型菌株植酸酶酶活为384.28 U/m L,相比野生型提高了2.09倍;PAS＿chr1-1＿0353缺失型菌株酶活为440.87 U/m L,相比提高2.4倍。（4）对PAOX1启动子基因AOX1进行转录水平检测。结果显示,植酸酶表达量与AOX1基因转录水平呈正相关。酶活提高最明显的PAS＿chr2-1＿0641缺失型基因在甲醇诱导第2 h、4 h及42 h,AOX1转录水平有所提高;PAS＿chr1-1＿0353基因在甲醇诱导全过程中AOX1转录水平明显高于野生型,证明PAS＿chr1-1＿0353与PAOX1的调控有着密切关系。MAPK信号通路:（1）利用CRISPR/Cas9编辑系统,成功构建19个MAPK通路基因缺失型菌株:ΔPAS＿chr2-2＿0131、ΔPAS＿chr2-1＿0203、ΔPAS＿chr1-1＿0348、ΔPAS＿chr3＿0637、ΔPAS＿chr1-1＿0096、ΔPAS＿chr3＿0092、ΔPAS＿chr4＿0093、ΔPAS＿chr2-1＿0263、ΔPAS＿chr1-3＿0159、ΔPAS＿chr4＿0986、ΔPAS＿chr4＿0584、ΔPAS＿chr1-3＿0225、ΔPAS＿chr1-3＿0307、ΔPAS＿chr3＿0673、ΔPAS＿chr3＿0618、ΔPAS＿chr3＿0861、ΔPAS＿chr1-1＿0165、ΔPAS＿chr1-4＿0069、ΔPAS＿chr3＿0840。（2）测定基因缺失型菌株对葡萄糖、甘油、甲醇不同碳源培养基中的生长情况。结果显示,PAS＿chr2-2＿0131基因的缺失对葡萄糖代谢的促进最为明显,其次对甲醇代谢也有一定的促进作用;基因PAS＿chr1-3＿0307、PAS＿chr3＿0861缺失后明显提高了甘油的利用率;基因PAS＿chr3＿0840的缺失使菌株在葡萄糖和甲醇中生长情况变差。（3）比较缺失型菌株与野生型菌株植酸酶的表达差异。结果显示,PAS＿chr2-2＿0131、PAS＿chr2-1＿0203、PAS＿chr1-1＿0348、PAS＿chr3＿0637、PAS＿chr4＿0093、PAS＿chr2-1＿0263、PAS＿chr4＿0986、PAS＿chr1-3＿0307、PAS＿chr3＿0673、PAS＿chr3＿0861、PAS＿chr1-1＿0165基因的缺失使植酸酶表达量有不同程度的提高。其中,PAS＿chr3＿0637缺失型菌株植酸酶酶活为316.01U/m L,相比野生型提高了2.09倍;PAS＿chr3＿0861缺失型菌株酶活为254.40 U/m L,相比提高1.68倍。（4）对PAOX1启动子基因AOX1进行转录水平检测。结果显示,植酸酶酶活提高的PAS＿chr3＿0637、PAS＿chr3＿0861缺失型基因,其AOX1基因转录水平也有所提高。综上所述,本研究通过改造自噬信号通路及MAPK信号通路的关键基因,为进一步提高毕赤酵母外源蛋白表达水平提供了理论参考。