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骨肉瘤是一种常见的恶性骨肿瘤，其特点是恶性瘤细胞直接形成骨样组织，故亦称为成骨肉瘤。但在部分骨肉瘤病例中肿瘤的成骨过程并不明显。骨肉瘤好发于青少年，股骨远端、胫骨近端和肱骨近端的干骺端。近年来由于化疗的应用使骨肉瘤的5年生存率有了显著的提高。但普遍存在的化疗药物耐药现象仍是制约着骨肉瘤治疗疗效的桎梏。因此基于特异性靶点研究新的化疗药物成为目前关于骨肉瘤治疗策略研究的重要课题。近年来，大量实验研究数据表明肿瘤细胞的发生发展与细胞内线粒体凋亡途径密切相关，为我们研究肿瘤发生发展的分子机制提供了重要线索。最近，人们发现蟾酥在具有强大的抗癌活性，引起了肿瘤学领域的广泛关注[1-4]。目前人们围绕着蟾酥的抗癌活性，已分离出多种活性单体成分[3]，发现这些化合物可以上调P53蛋白的表达并上调Bax／Bcl-2表达比值，诱导骨肉瘤细胞发生线粒体凋亡。酯蟾毒配基是蟾酥的有效成分之一[5]，已在多种人类恶性肿瘤中发现其确切的抗癌活性[6-8]。在预实验中我们发现酯蟾毒配基可以显著抑制骨肉瘤SAOS-2细胞，我们推测其抗癌活性涉及由多种凋亡调控因子介导的线粒体凋亡途径。目前国内实验主要以中草药提取物和中成药制剂治疗骨肉瘤为研究方向，其中蟾酥水提物在中成药制剂中占有重要地位[9-11]，为我们研发新的抗骨肉瘤药物提供思路。本研究拟通过细胞培养技术在体外水平观察酯蟾毒配基对骨肉瘤细胞的作用，通过MTT试验，观察酯蟾毒配基对骨肉瘤细胞增殖能力的影响，运用流式细胞仪技术探讨该过程中线粒体凋亡途径的激活，并利用Western Blotting技术检测酯蟾毒配基作用后骨肉瘤细胞内重要的凋亡调控蛋白的表达量，从而了解酯蟾毒配基的抗癌机制，为骨肉瘤的个体化治疗方案及新的化疗药物开发提供可靠的理论依据。实验方法1.细胞生长抑制试验-MTT法将SAOS-2细胞培养于含10%FBS的DMEM培养基中，37℃，5%CO2培养，隔日换液，0.25%胰蛋白酶消化传代。待细胞长至80%融合时，胰酶消化，PBS洗两次，无血清培养基调制SAOS-2细胞浓度为2×104/ml接种于96孔平板，每孔100μl (2000个/孔)。设置空白对照及不同浓度实验组。随即在24h的时间点上加入滤过的10μl MTT工作液(5mg/ml)，37℃孵育4h，加入100μlDMSO溶液终止反应。在595nm处检测吸收峰值并进行统计分析。2. Annexin-V/PI染色检测细胞凋亡细胞培养、加药步骤同上。待细胞长至80%融合时，消化细胞，制成细胞悬液，进行细胞计数。30000个/孔SAOS-2细胞铺板，培养48小时，收集培养上清于15mL离心管中，用胰酶消化贴壁细胞收集于同一离心管中，离心1500rpm×5min；用1mL预冷的PBS洗涤细胞一次，转移细胞至1.5mL离心管，4°C离心1500rpm×5min收集细胞；用500μL预冷PBS重悬细胞，并吹散成单细胞悬液；离心1500rpm×5min，弃上清；加入250μL Binding Buffer重悬细胞，加入10μL Annexin-V，暗反应0.5小时；离心1500rpm×5min，弃上清；加入250μL Binding Buffer重悬细胞，加入10μLPI，上机。3. Western Blotting实验在不同浓度的酯蟾毒配基处理肿瘤细胞24h后，用细胞刮刀收集贴壁SAOS-2细胞置于裂解液中。待裂解充分用BCA法测定总蛋白浓度。取20μg蛋白样品在10%SDS-PAGE进行电泳。随即电转至PVDF膜(Millipore, Billerica, MA, USA)上。用含有5%脱脂牛奶的封闭液进行封闭，然后用P53一抗(Mouse IgG,1:1000dilution, Beyotime, Cat.No.AP062)和内参β-actin一抗(Mouse IgG,1:1000dilution, Beyotime, Cat.No. AA128)，4C过夜孵育。TBS-T洗PVDF膜3次后，加入二抗Anti-mouse IgG，HRP-linkedAntibody(Source:goat,1:2000dilution, Beyotime, Cat.No.A0216)在室温孵育2h。TBS-T洗膜3次后，用chemiluminescence法(Amersham，UK)进行曝光。结果及讨论为了探究酯蟾毒配基对骨肉瘤细胞增殖能力的影响，我们采用MTT实验检测不同浓度酯蟾毒配基处理后的骨肉瘤细胞增殖情况。MTT检测结果显示，酯蟾毒配基在60μM的浓度时显著抑制骨肉瘤细胞的增殖能力。为了研究该化合物抑制骨肉瘤细胞增殖的机制，我们运用流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡发生情况，发现在40μM的时候酯蟾毒配基可以显著诱导细胞进入凋亡。此外，Western Blotting结果显示酯蟾毒配基可以上调骨肉瘤细胞P53等蛋白表达量。该结果提示，酯蟾毒配基可能通过激活P53蛋白及其他凋亡因子，触发骨肉瘤细胞发生凋亡，从而抑制肿瘤细胞的生长。综上所述，在本研究中，我们将不同浓度的酯蟾毒配基处理骨肉瘤SAOS-2细胞，并在体外水平研究酯蟾毒配基对肿瘤细胞生长的影响。我们发现酯蟾毒配基极大地减弱了肿瘤细胞的增殖能力。此外，我们通过Western Blotting实验观察到酯蟾毒配基可以上调骨肉瘤细胞P53蛋白的表达水平，提示酯蟾毒配基抑制骨肉瘤细胞增殖过程涉及凋亡机制。这些研究结果均首次报告酯蟾毒配基对骨肉瘤SAOS-2细胞的抑制作用，在国内、国外均未见报道。