研究背景:研究显示肾间质病变与慢性肾功能衰竭进展关系密切,肾间质纤维化几乎是各种肾脏疾病进展到终末期的共同途径和主要病理基础。研究其病理过程和发生机制,寻找延缓和阻断肾脏纤维化新靶标,是目前国内外肾脏病研究的热点方向。其中肾脏纤维化过程中,多种细胞因子和生物活性物质参与肾间质纤维化的发生发展:转化生长因子等纤维化的正性调节因子,及肝细胞生长因子、骨形态发生蛋白等纤维化的负向调节因子通过生物信号传导机制链接起来,形成完善的反馈系统,调节机体的病理生理过程。但研究得最多和最为成熟的是转化生长因子TGF-β1在肾脏纤维化中的作用机制。而纤维化最显著特征是肌成纤维细胞的增生和细胞外基质(extracelluarmatrix,ECM)的过度沉积。基本上表现出相似的特征,即大量的成纤维细胞转化为肌成纤维细胞。肾纤维化的细胞机制即是成纤维细胞激活为肌成纤维细胞(myofibroblast,MF),肾间质纤维化的主要特征是出现MF,MF是肾间质纤维化中产生基质蛋白的主要效应细胞。肾纤维化中,MF可来源于:(1)肾间质成纤维细胞;(2)血管平滑肌细胞;(3)肾小管上皮细胞。其中肾小管上皮细胞是MF的主要来源。纤维蛋白形成的自分泌过程和成纤维细胞和肌纤维母细胞来源的TGF-β1,持续刺激上皮细胞转化成为间充质细胞(epithelial-to-mesenchymal transition EMT),这成为纤维化过程中的一个重要机制。所以肾脏纤维化过程中TGF-β1成为公认的致纤维化因子:其活化过程主要是与细胞膜表面的TGF-βⅡ型受体结合,形成二元复合物,TGF-βⅠ型受体识别并结合该二元复合物。活化的TGF-βⅠ型受体进一步作用于细胞内的下游分子是途径限制性Smad蛋白(Smad2和Smad3),使TGF-β的信号向细胞内转导;通过和受体间的相互作用,TGF-β1诱导Smad蛋白磷酸化其下游信号分子Smad2/2及Smad2/3,后者与Smad4形成复合体,调节靶基因的表达。Smad蛋白是细胞内信号转导蛋白,依据结构和功能分为三型,即特异型Smads(R.Smads),包括Smad 1、2、3、5和8;公共调节型Smads(C.Smads),即Smad 4;抑制型Smads(I.Smads),包括Smad 6、7。其中I.Smad具有负调控作用,在磷酸化的R.Smad和Smad4的转录调控下I.Smad表达增高,而I.Smad通过其结构域与活化的TGF-βⅠ型受体结合,使R.Smad不能与TGF-βⅠ型受体结合,从而抑制R.Smad磷酸化,阻止受体复合物的形成及转位入核;也可通过一些调节蛋白如Smad泛素调节因子降解TGF-βⅠ型受体进而抑制信号传导。Smad蛋白2和3在人近端小管上皮细胞调节TGF-β1诱导的促纤维化作用并不相同,利用RNA干扰技术分别沉默Smad蛋白2和3,发现TGF-β1处理过的人近端小管上皮细胞结缔组织生长因子(CTGF),基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和α平滑肌动蛋白(α-SMA)表达上调,而上皮细胞钙粘蛋白表达下调。TGF-β1诱导的CTGF表达上调和上皮细胞钙粘连蛋白下调具有Smad3依赖性,MMP-2上调依赖于Smad2;α-SMA的表达则依赖两者的联合作用。也有研究发现肝细胞生长因子通过阻断TGF-β1诱导的EMT过程抑制纤维化形成,肝细胞生长因子对TGF-β1介导的Smad2蛋白磷酸化和随后的核转位过程没有影响,对抑制性蛋白Smad6和7的表达也不起作用,它是通过特异性诱导Smad蛋白转录辅阻遏物SnoN和TG交互因子的表达而抑制Smad蛋白转录,这个发现说明在肝细胞生长因子受体酪氨酸激酶和TGF-β1受体丝氨酸-苏氨酸激酶之间存在一个新的信号活化过程,也说明抑制Smad蛋白转录修饰因子的表达也是治疗肾脏纤维化一个可行的策略。目前关于TGF-β的研究很多是从它的信号转导途径入手的,目前研究比较多的信号系统包括Smad信号通路、P38 MAPK信号通路、ERK信号通路等,其中Smad信号通路是其中研究比较透彻也是最为重要的信号通路。其中在Smad信号通路中发现骨形态发生蛋白-7(BMP-7)介导了肾脏负向调节过程,在肾脏发育过程中,BMP-7广泛表达于各种肾脏细胞中,主要表达于集合管、远端肾小管、髓袢升支厚壁段和肾小球足细胞,BMP-7通过旁分泌和自分泌方式与肾小球和肾小管的Ⅱ型受体结合后再与Ⅰ型受体结合,使Ⅰ型受体磷酸化而作用于信号分子Smad1和Smad5,使Smad1/5磷酸化及与Smad4结合成复合体,移位到细胞核内,启动靶基因转录,引起相应的生物效应。BMP-7介导的信号活化smad 1、5和8,而TGF-β活化Smad 2和3。然后这些活化的Smads作用于Smad4,继而这种复合物转移到细胞核内,调节目的基因的转录。TGF-β和BMP-7的信号通路通过正向和负向的调节机制紧密联系在一起:其中一个很重要的负向反馈机制为抑制性Smads(Smad6/7)蛋白的产生。Smad6优先抑制BMP的信号通路,Smad7则抑制TGF-β/activin的信号通路。Smad7通过蛋白酶体家族成员E3-ubiquitin酶结合产生遍在蛋白化作用和降解TGF-β受体发挥作用;同时还阻断了Smad2和Smad3蛋白的磷酸化,使得TGF-β的信号转导过程受阻,成为TGF-β的负反馈机制环路。减少Smad7蛋白的表达在单侧输尿管梗阻模型中导致了小管间质性的纤维化。TGF-β通过Smad 3/4,AP-1,SP1,和TFE3调节的Smad蛋白结合位点诱导Smad7的表达;BMP-7则是通过多重的BMP反应原件(BRE)诱导Smad7的表达。其中有两个低亲和力的位点:BRE-1/2在BMP高浓度是被激活,还有一个高亲和力的位点I-BRE在BMP低浓度时就可被激活。BRE-1/2和Smad1/4复合物结合、I-BRE和Smad1/4/GATA结合。这提示转录因子GATA可能增强Smad7介导的阻断TGF-β信号通路过程,同时在BMP低浓度时就诱导Smad7的产生从而启动肾脏纤维化负反馈调节机制。目前国内和国际上关于转录因子GATA-3的研究主要集中在肺脏及肝脏等器官上,邓群益等通过对大鼠哮喘模型的研究发现:GATA-3反义寡核苷酸能特异性地抑制GATA-3基因的表达,减轻气道炎症反应。AmericanJournal of Pathology上的一篇文献进一步支持了该理论,这篇文献提示GATA-3的过表达增加了肺脏纤维化的发展过程,可能是通过减少了干扰素-r的产生而发挥作用,但是关于GATA-3在肾脏组织的表达情况及其对肾脏纤维化进程中信号通路的影响国内外未见相关报道,对其他纤维化因子TGF-β、BMP—7的影响也未进一步探究;所以本研究利用GATA-3反义寡核苷酸在基因水平上封闭GATA的表达,在基因和组织水平上检测GATA-3的表达水平的改变情况,观察BMP-7和Smad7的表达变化,探讨其中的机制,以便为纤维化疾病的治疗和研究提供有益的启示。目的:1、观察在单侧肾脏梗阻模型中转录因子GATA-3在不同处理因素大鼠肾脏中的表达情况,了解它在肾脏纤维化进程的作用;2、在动物水平上初步探讨转录因子GATA-3反义寡核苷酸药物的干预意义;研究方法:1、将36只雄性SPF级Wistar大鼠随机分为单侧输尿管梗阻组(UnilateralUreteral Obstruction group UUO)和正常对照组,单侧输尿管梗阻组按照处理因素再分为GATA-反义寡核苷酸组(antisense oligonucleotide groupAS),GATA-3无意义寡核苷酸组(nonsen3 se oligonucleotide group NS)和生理盐水组,每组各6只。正常对照组18只大鼠采取同样的分组方法。分别在试验第1、7、14d处死每小组2只大鼠,HE和Masson染色观察肾脏纤维化的病理变化并评估纤维化程度。2、采用SABC法检测GATA-3、Smad7、BMP-7、TGF-β1的阳性表达情况并统计面积。3、RT-PCR方法观察大鼠肾脏组织GATA-3及Smad7 mRNA表达同时计算灰度值。4、实验数据以均数±标准差(x±s)表示,所有数据采用SPSS13.0统计软件统计,采用完全随机分组多因素析因设计和方差分析方法进行统计分析,相关性分析用Sperrman相关系数进行分析。结果:1、GATA-3表达结果:UUO及正常对照组GATA-3均存在表达,阳性部位主要见于肾小管及肾间质,肾小球部分表达,肾小球光密度高于肾小管及肾间质。UUO组表达弱于正常对照组(F=8.233,P=0.010)。2、BMP-7表达结果:在UUO组及正常对照组亦可见BMP-7表达,主要分布在肾小管及肾间质,近端小管及集合管均有表达,而在肾小球基本无表达。UUO组及正常对照组之间表达差异有显著性,UUO组中表达要低于正常对照组(F=20.669,P=0.000),并随着梗阻时间的延长表达逐渐下降。3、Smad-7表达结果:UUO组Smad-7也存在表达,主要见于肾小管及肾间质、近端小管、集合管及远端小管,肾小球表达不显著,UUO组表达低于正常对照组,两组之间表达差异有显著性(F=63.604,P=0.000),不同处理因素之间差异也有显著性(F=5.233,P=0.016),并且不同时间之间表达差异也存在显著性(F=6.109,P=0.009)。4、TGF-β1表达结果:TGF-β1在肾小管及肾小管均存在表达,梗阻时间越长,肾小管及肾小管表达越明显,在肾小管上皮细胞胞浆中主要表达在近端小管中。UUO组与正常对照组之间该因子阳性面积差异有统计学差异(F=10.163,P=0.005),并且不同时间段表达差异也存在显著性(F=21.828,P=0.000),在UUO组不同时间不同药物间的表达具有差异显著性,但是在正常对照组不同处理因素间差异无统计学意义。5、RT-PCR结果:在UUO组及正常对照组均观察到GATA-3及Smad7的表达,其中反义寡核苷酸处理过的大鼠与无意义寡核苷酸及生理盐水处理的大鼠GATA-3的表达差异有显著性,UUO的表达要低于正常对照组(F=10.922,P=0.004)。对Smad7的表达分析发现在UUO组中和正常对照组之间差异具有显著性,UUO组表达低于正常对照组(F=17.668,P=0.001),并且不同处理因素差异也具有显著性(F=29.578,P=0.000)。结论:1、在肾脏纤维化过程中GATA-3在其中的信号通路中也发挥了作用;2、反义寡核苷酸通过封闭GATA基因的表达,阻断高亲和力位点I-BRE和BRESmad1/4/GATA的结合,减少BMP-7诱导的Smad7表达;3、转录因子GATA-3反义寡核苷酸经过反复和长时间的给药基本上达到了有效的药物浓度,并且和GATA-3的结合呈递增效应;4、在肾脏纤维化过程中,许多细胞因子都发挥了相应作用,本研究其中通过制作动物模型,采用反义寡核苷酸封闭GATA-3的表达,加重了肾脏纤维化过程,说明对信号转导机制进行干预来影响纤维化进程是可行的。