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随着对大段骨缺损修复研究的深入，其治疗方法逐步从传统的自身骨移植、同种异体骨移植等治疗手段深入到人工骨材料、基因工程领域。然而，到目前为止这些工程化的组织大部分局限于动物模型上的研究而难以在人体上使用，其主要原因之一就是在工程化的组织中难以建立有效的功能性的血管网络。所以，如何促进大段骨缺损修复过程中工程骨的血管再生已经成为亟待研究解决的问题。 近年来的研究发现，在骨缺损的修复过程中血管内皮细胞生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF）对于其它细胞因子是一个中间的连接因子。而且，骨形态发生蛋白（Bone Morphogenetic Proteins,BMPs）通过成骨细胞产生VEGF而促进血管的生成。VEGF和BMPs二者在促血管生成中具有协同作用从而促进骨的形成。 本实验的主要目的，是通过体外构建VEGF165和BMP2真核表达载体，应用体内基因转染（in vivo）技术，结合我们研制开发的新的骨缺损修复材料—纳米羟基磷灰石／聚酰胺修复材料（n-HA/PA），并辅助应用引导性骨再生（Guided Bone Regeneration,GBR）技术来治疗大段骨缺损。初步对修复材料与质粒DNA的复合方法、质粒DNA的局部用重庆医科大学博士学位论文二量进行了探讨，为下一步骨缺损修复的基因治疗奠定一定的基础。本研究主要由四部分组成:第一部分人vEGF165一红色荧光融合蛋白表达载体的构建和鉴定 目的构建在哺乳动物细胞中表达人vEGF165（hVEGF165）红色荧光蛋白（RFP）的融合蛋白表达载体。方法根据已知的人VEGF165序列，设计在目的片段两端分别带Hindlll和Sac 11酶切位点的两条引物。用PcR方法从质粒puc18/V EGF165中扩增出去除了终止密码子的人泥oF165（573bp）基因片段，经Hindlll和Sae 11双酶切后回收纯化，定向克隆至含有以红色荧光蛋白为报告基因的真核表达质粒pDsRedl一Nl中。重组质粒pDsVEGF，65Redl一Nl用限制性内切酶酶切、PCR方法和DNA序列测定分析鉴定。结果重组的融合蛋白表达载体经酶切、PCR和DNA序列测定证明构建正确，读码框无移位。结论成功构建了pDsVEGF165Redl一 Nl红色荧光蛋白融合表达载体，为研究VEGF的细胞内定位以及体内基因治疗提供了一个重要而方便的工具。第二部分携带IREs的BMp:绿色荧光蛋白表达载体的构建和鉴定 目的构建携带有骨形态发生蛋白基因的PIREs增强型绿色荧光蛋白真核表达载体，为BMP:基因的体内外表达及蛋白定位提供理想的标记。方法用EcoRI、Xbal双酶切携带有目的基因的质粒pCDAN3.z胆MPZ，获得1.25Kb的BMPZeDNA;将此片段亚克隆至pUC18载体上，随后用Sall单酶切重组质粒puers一BMPZ，再次获得BMP:cDNA，同时用sall单酶切PIRESZ一EGFP载体将其线性化，并行去磷酸化修饰。用几DNA连接酶将二者连接、转化感受态细菌重庆医科大学博士学位论文DH5a。先以Sa一I单酶切重组体pIRESZ一BMpZ一EGFp，筛选阳性克隆，再以EcoRI、PshAI酶切筛选的阳性克隆鉴定插入的方向，同时进行测序。结果重组载体经酶切鉴定，证明插入的方向正确，目的片段的大小与实验设计时的分析相符合，经DNA序列测定证明无读码框的移位。结论成功构建了PIRESZ一BMPZ一EGFP增强型绿色荧光蛋白表达载体，为研究BMP:的细胞内定位和体内基因治疗提供了一个重要而方便的工具。第三部分重组质粒pDs泥oF165Redl一Nl、pIRESZ一BMpZ一EGFp在真 核细胞中的表达 目的检测构建的重组质粒pDsVEGF165Redl一Nl、pIRESZ一BMpZ-EGFP在细胞水平的表达效率，为体内基因治疗提供基础;方法收获处于指数生长期细胞约lx105个，将细胞接种于6孔细胞培养板中，置于37℃、5%CO:培养箱中培养24小时，使细胞达到50一80%融合。用转染试剂Do1Ap（Roehe公司），按照说明书将pDsVEGF，65Redl一Nl和PIRESZ一BMPZ一EGFP质粒分别或同时转染入293一T细胞。转染后48小时用荧光显微镜及激光共聚焦显微镜观察荧光蛋白的表达情况及转染效率并拍照;用Rl:PCR方法检测各组细胞中VEGF165和/或BMPZ的mRNA水平的表达;用western Blotting方法检测VEGF165、BMpZ在蛋白水平的表达。结果转染后8小时，在荧光显微镜下可以观察到荧光蛋白的表达，36一48小时为荧光蛋白表达的高峰期;转染48小时后，在激光共聚焦显微镜下观察，90%的荧光蛋白分布于整个细胞中，细胞浆和胞核分布上未见明显差异。在pDsVEGF165Redl一Nl重组载体 季感辱科冬尝竺舌学鱼鱼兰一一一一—转染组可胞外有红色荧光颗粒。在转染48小时后，收集细胞提取RNA后，用Rl’- PCR方法检测细胞总RNA中目的基因mRNA的表达，结果均为阳性，说明在转录水平有VEGF、BMP目的基因的表达。westernBlotting结果显示有vEGF、BMP目的蛋白的特异条带。结论重组质粒pDsVEGF165Redl一Nl、pIRESZ一BMpZ一EGFp均可在293一T细胞中表达，未见荧光蛋白的表达在细胞浆和细胞核分布上有明显差异。第四部分重组质粒pDsvEGF165Redl一Nl、pIREsZ一BMPZ一EoFP在兔 大段骨缺损中的作用