贝类派琴虫原位杂交检测技术研究

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派琴虫病(Perkinsosis)是严重危害全球贝类养殖业的主要疫病,也是进出口贝类产品贸易中的重要检疫性疫病,目前,世界动物卫生组织(OIE)将雷氏液体巯基醋酸盐培养基(RFTM)培养法作为派琴虫(Perkinsus)检测的金标准,但其不能区分腰鞭毛虫(Dinflagellate);另外,鉴于我国口岸检疫现阶段普遍采用的PCR检测方法存在假阳性率过高的缺陷;本研究通过采用随机引物标记法,制备派琴虫特异性核酸探针,首次建立了派琴虫原位杂交(ISH)检测方法。探针标记效率检测表明,所制备派琴虫核酸探针含量达到100ng/μL;Southern bolt检验证实探针特异性强,与贝类包拉米虫(Bonamia)、单孢子虫(Haplosporidium)等无交叉反应,为派琴虫属通用探针;以OIE推荐的雷氏液体巯基醋酸盐培养基培养法作为标准方法,对实验室采集的20份贝类样品进行派琴虫感染检测表明,本研究所建立派琴虫原位杂交检测方法的诊断敏感性为90.9%,诊断特异性为100%。利用所建立的原位杂交方法,对实验室采集的蛤仔和牡蛎进行检测的结果显示,我国黄海海域的菲律宾蛤仔和文蛤均有派琴虫感染,而牡蛎样品没有检出。贝类派琴虫原位杂交检测方法的成功建立,既满足了我国口岸进出境贝类派琴虫检疫需求,也为我国贝类养殖场派琴虫流行病学调查提供了技术支持。
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