【摘 要】
：
在哺乳动物中,14-3-3家族蛋白包含（γ、η、β、ζ、σ、ε、θ）7个成员,其蛋白序列高度保守,参与众多细胞生物学过程,例如蛋白质运输、信号转导、物质代谢、凋亡以及细胞周期的调节。14-3-3作为衔接蛋白,通过结合磷酸化的丝氨酸或者苏氨酸保守基序,与许多蛋白互作,从而影响蛋白的定位,稳定性和活性。现集中于对14-3-3与磷酸化蛋白的互作模式及功能研究,而14-3-3蛋白本身的磷酸化机制及功能并不
论文部分内容阅读
在哺乳动物中,14-3-3家族蛋白包含（γ、η、β、ζ、σ、ε、θ）7个成员,其蛋白序列高度保守,参与众多细胞生物学过程,例如蛋白质运输、信号转导、物质代谢、凋亡以及细胞周期的调节。14-3-3作为衔接蛋白,通过结合磷酸化的丝氨酸或者苏氨酸保守基序,与许多蛋白互作,从而影响蛋白的定位,稳定性和活性。现集中于对14-3-3与磷酸化蛋白的互作模式及功能研究,而14-3-3蛋白本身的磷酸化机制及功能并不清楚。正常生理条件下,c AMP依赖的蛋白激酶A（PKA）由催化亚基和调节亚基组成全酶复合物,不具备激酶活性。但当细胞内c AMP升高时,PKA调节亚基与c AMP结合,PKA构象发生改变,这导致PKA的调节亚基与催化亚基解离,PKA发挥激酶功能。14-3-3蛋白具有保守PKA磷酸化基序,本项目证明PKA磷酸化14-3-3家族蛋白中的14-3-3γ、14-3-3β、14-3-3η、14-3-3ζ和14-3-3ε五个成员,并阐明其磷酸化位点。进一步,以PKA诱导14-3-3磷酸化为研究模型,探讨14-3-3的磷酸化对其定位和二聚化的影响。方法:（1）PKA的活性对14-3-3磷酸化的影响（1.1）使用PKA激动剂或者过表达PKA Cα激活PKA,探讨PKA激活对14-3-3蛋白磷酸化的影响（1.2）使用PKA抑制剂或者下调PKA Cα抑制PKA,探讨PKA抑制对14-3-3磷酸化的影响（2）外源表达14-3-3家族蛋白成员,检测PKA激活对外源14-3-3蛋白的影响。（3）14-3-3与PKA蛋白互作（3.1）通过免疫共沉淀的方法检测PKA和14-3-3的互作。（3.2）通过免疫共沉淀的方法检测PKA和14-3-3互作的关键区域。（4）14-3-3为PKA底物（4.1）在体外,使用纯化的14-3-3与PKA蛋白进行体外磷酸化实验。（4.2）在细胞内,通过p-PKA Substrate抗体检测14-3-3是否为PKA的底物。（4.3）突变14-3-3蛋白预测的PKA磷酸化位点,检测PKA对14-3-3突变体磷酸化的影响。（5）14-3-3磷酸化的功能（5.1）免疫荧光检测PKA激活对14-3-3定位的影响。（5.2）使用交联剂检测14-3-3磷酸化对其二聚体形成的影响。结果:1.PKA激活促进14-3-3蛋白磷酸化（1.1）在不同细胞系中,PKA的激动剂促进14-3-3磷酸化。（1.2）PKA Cα促进14-3-3磷酸化,但过表达激酶失活型PKA不具有该效应。（1.3）PKA上游GPCR信号的激活促进14-3-3磷酸化。（1.4）PKA的抑制剂或下调PKA Cα抑制14-3-3磷酸化。（1.5）PKA的催化亚基PKA Cα而非PKA Cβ及PKA Cγ促进14-3-3磷酸化。（2）PKA激活促进14-3-3（γ、η、β、ζ）的磷酸化。（3）14-3-3与PKA蛋白互作的研究（3.1）PKA Cα与14-3-3蛋白互作,而PKA调节亚基不能与14-3-3互作。（3.2）PKA与14-3-3的N端（1-80）位氨基酸发生相互作用。（4）14-3-3为PKA的底物（4.1）PKA在体外磷酸化14-3-3。（4.2）PKA促进γ（S59）,η（S59）,β（S60）,ζ（S58）和ε（S59）位点磷酸化。（5）PKA介导的14-3-3磷酸化不影响14-3-3定位和二聚体形成。结论:PKA信号通路激活促进14-3-3家族蛋白（γ、η、、β、ζ和ε）的磷酸化,磷酸化位点分别为其保守的γ（S59）、η（S59）、β（S60）、ζ（S58）和ε（S59）位点;PKA与14-3-3的N端（1-80）位氨基酸互作;PKA介导的14-3-3磷酸化并不影响14-3-3蛋白的定位和二聚体形成。
其他文献
目的:钙化性主动脉瓣膜疾病（Calcifiedaorticvalvedisease,CAVD）是一种常见心脏瓣膜病,在我国老年人口中具有较高的发病率。研究表明,CAVD由内皮损伤、脂质浸润、慢性炎症、细胞成骨分化等一系列复杂变化引起,涉及不同类型的细胞间相互作用,然而各类型细胞在CAVD疾病进展中的具体功能机制尚不明确。瓣膜内皮细胞（Valvular endothelial cells,VECs）
肝脏缺血再灌注（ischemia-reperfusion,I/R）损伤是肝脏手术中影响术后死亡率的常见并发症。再灌注阶段会产生大量活性氧导致氧化应激,造成组织损伤。泛素蛋白酶体系统是常见的蛋白质翻译后修饰系统,可参与调控细胞生命活动。探究肝脏I/R中关键抗氧化蛋白的泛素化与去泛素化的动态修饰机制至关重要。核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related f
背景:食管癌是发生在食管上皮组织的恶性肿瘤,是世界第七大癌症。在中国,食管癌患者类型以鳞状细胞癌为主,占90%以上,整体5年生存率小于20%。近年来,联合应用靶向药物是一种非常有前景的肿瘤治疗方式,但针对食管鳞状细胞癌的靶向药物较少,且临床获益不佳。因此,寻找食管鳞状细胞癌发生发展的分子机制,确定食管鳞状细胞癌新的治疗靶标,为食管鳞状细胞癌的联合治疗提供新视角十分必要。RIOK3（RIO kina
目的:外侧隔核（lateral septum,LS）是一个调节机体多种情感和功能的重要脑区,如焦虑、恐惧、奖赏、进食和社交。在细胞分类和神经解剖学上,LS脑区中的神经元主要为抑制性GABA能神经元,与奖赏调节的经典脑区之间存在神经投射,如腹侧被盖区、伏隔核和外侧下丘脑等。研究表明LS脑区在调控巴普洛夫条件反射中对奖赏信息的处理起重要作用,然而LS脑区是否调控操作性条件反射尚不明确。基于此,本课题重
背景:日光性皮炎是一种过量紫外线照射后引起的炎性皮肤病。紫外线照射会诱导蛋白激酶p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase,p38）和JNK（c-Jun N-terminal kinase,JNK）的磷酸化激活,促进日光性皮炎的发生。Janus蛋白激酶2（Janus kinase 2,JAK2）是非受体酪氨酸蛋白激酶,参与多种炎症性免疫疾病,
人类基因组会不断受到内源或外源因素的损伤,基因组损伤会导致遗传信息的丢失或异常表达,严重的基因组损伤可能导致个体发育异常或者促进肿瘤的发生发展。生物体在进化过程中衍生出一套完整的DNA损伤修复机制,当基因组受到攻击时,细胞内部会启动DNA损伤修复机制来阻止其产生严重后果,所有检测、传输DNA损伤信号并促进基因组修复的机制被称为DNA损伤反应（DNA Damage Response,DDR）。DNA
自1998年RNA干扰现象被发现以来,调控性小非编码RNA的成员日益扩大,越来越多的研究证明这些小非编码RNA对生长发育和基因表达调控具有举足轻重的地位。其中PIWI-interacting RNA（pi RNA）不仅可以介导转座子的沉默,促进表观遗传修饰,参与转录水平和转录后水平的基因调控,还能识别并沉默外来序列,抵抗病毒入侵,从而维持基因组的完整性和稳定性。从低等动物到高等动物人类,pi RN
研究背景:有丝分裂末期,ESCRT-Ⅱ/Ⅲ蛋白CHMP7与核膜蛋白LEM2相互作用并结合ESCRT-III其他组分参与核膜重塑过程。但CHMP7在间期中的潜在作用尚不清楚。研究目的:探索CHMP7在细胞分裂间期的亚细胞定位、功能及相应的分子机制和生理意义。研究内容:通过Western Blots检测不同细胞周期及小鼠不同组织内CHMP7的表达量。借助免疫荧光技术观察CHMP7的亚细胞定位,并提取膜
视网膜作为中枢神经系统不可或缺的一部分,能将外界图像转换成视觉信息并传递至大脑,其结构和功能完整性对视觉至关重要,且损伤机制与中枢神经系统损伤机制有较多相似之处。视网膜缺血再灌注（Ischemia and reperfusion,I/R）损伤参与了多种眼科疾病的发生和发展过程。这些眼科疾病是导致患者视力损伤和失明的主要原因,也被认为是视神经退行性病变类型之一,其特征是视网膜神经节细胞（Retina
背景:多形性胶质母细胞瘤是中枢神经系统中最常见的原发性肿瘤,占胶质瘤的50%左右。具有肿瘤异质性高、侵袭性高等特点,患者预后差,复发率高,中位生存期短。现有的针对胶质瘤的分子靶向药物的临床效果有限,对其新的分子机制研究有助于探索新的分子治疗靶点。研究表明YANK2在胶质瘤中表达水平高,且与患者预后相关。但是YANK2在胶质瘤中的具体作用及其机制尚不清晰。目的:本研究旨在探索YANK2在胶质瘤中的具