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CRISPR/Cas9是一项崭新而高效的基因编辑技术,广泛应用于微生物、植物与动物的基因改造。为提高CRISPR/Cas9的基因编辑效率,有多种方法对其系统进行改进。有报道证明由截短的gRNA(tru-RGNs,17/18 nt)所介导的Cas9核酸酶在人体细胞的基因修饰过程中可显著地降低脱靶效应,但不影响其靶向效率。但尚无研究表明该方法能用于构建基因敲除(KO)动物。本研究将揭示tru-RGNs对小鼠细胞基因组编辑的特异性,并应用tru-gRNA和Cas9 mRNA快速构建FVⅡKO小鼠模型。本论文选择小鼠FVⅡ基因第二外显子(启动子下游)作为靶位点,设计识别三个不同位点的tru-RGNs,构建三组tru-RGNs (tru-gRNA+Cas9)表达载体,将它们转染到小鼠的NIH/3T3细胞中,std-RGNs (20 nt)作为对照。结果显示,ctF7-2相对于cF7-2突变率明显提高(49.5%vs 30.1%),ctF7-1与ctF7-3相对于cF7-1与cF7-3突变率略有下降(ctF7-1,12.1%vs cF7-1,23.6%；ctF7-3,7.7%vs cF7-3,10.9%)(P<0.05)。对其脱靶检测,结果发现它们在预测的脱靶位点上均出现脱靶,tru-RGNs vs std-RGNs脱靶突变无显著差别。在小鼠水平,将tru-gRNA与std-gRNA和Cas9片段通过T3启动子体外转录RNA共注射小鼠胚胎。Tru-gRNA(tF7-1,tF7-2,tF7-3)和Cas9 mRNA一起注射胚胎,分别注射胚胎98枚,75枚和120枚,出生小鼠38只,20只,20只；std-gRNA(F7-1,F7-2,F7-3)和Cas9 mRNA作为对照,分别注射胚胎78枚,110枚和80枚,出生小鼠18只,24只,6只。出生小鼠经引物F7-667-fl/F7-667-rl PCR扩增后,T7EI实验检测突变,结果显示tF7-1,tF7-2,tF7-3分别有19只(55.0%),15只(80.1%),8只(39.4%)检测到突变,F7-1,F7-2,F7-3分别有1只(3.7%),8只(35.8%),2只(27.8%)。对其脱靶检测,除了tF7-3在预测脱靶位点有突变(OT3-2,29.3%),其余小鼠中没有检测出脱靶突变。F0 FFⅡ KO小鼠凝血酶原时间测定,与野生型小鼠相比,其凝血酶原时间显著延长(P<0.05),Western blot显示,其第七凝血因子表达量低于1/2WT。将F0代阳性小鼠进行繁殖,出生小鼠T7EI检测到突变鼠,说明FVII KO能稳定遗传。总的来说,应用tru-gRNA可高效制备出基因敲除小鼠,其效率要比std-gRNA高。当gRNA的识别核苷酸由20 nt缩短到17nt或18 nt后,Cas9基因编辑的效率和特异性变化,表现出位点特异性。显微注射RNA制备的基因敲除小鼠,其脱靶风险要比培养细胞低很多。通过CRISPR/Cas9技术制备FVⅡ KO小鼠模型,可用于治疗遗传性凝血因子七缺乏症药物研究和该疾病的治疗研究。