青蒿琥酯联合阿奇霉素抗弓形虫感染治疗效果的研究

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目的:1.检测青蒿琥酯(Artesunate,Art)联合阿奇霉素(Azithromycin,Azm)体外抗弓形虫效果,观察药物对巨噬细胞内弓形虫感染的影响。2.初步探讨青蒿琥酯联合阿奇霉素对急性弓形虫感染小鼠的干预治疗作用。方法:1.采用虫体稳定表达绿色荧光蛋白的弓形虫RH株(RH-GFP)经腹腔感染小鼠,以速殖子感染腹腔巨噬细胞后流式检测。实验分4组:(1)生理盐水对照组(control);(2)青蒿琥酯组,使其终浓度分别为1.5625,3.125,6.25,12.5,25,50,100和200μg/ml;(3)阿奇霉素组,终浓度分别为12.5,25,50,100,200,400,800和1600μg/ml;(4)青蒿琥酯联合阿奇霉素组,终浓度分别为:Art1.5625+Azm12.5,Art3.125+Azm25,Art6.25+Azm50,Art12.5+Azm100,Art25+Azm200和Art50+Azm400μg/ml。各组孵育24h后利用流式细胞术检测弓形虫感染巨噬细胞中游离虫体、感染巨噬细胞和未感染巨噬细胞各组分比例的变化。荧光显微镜观察荧光改变,姬姆萨染色观察虫体形态变化。2.将方法1中各组孵育24h后的悬液收集洗涤后接种至小鼠腹腔,作再转种试验,观察速殖子复苏情况:包括小鼠发病表现、存活时间和腹腔液涂片镜检。腹腔液涂片查见虫体记录为阳性(+),无虫体则记录为阴性(-)。3.用1×10~3个弓形虫(RH-GFP)速殖子经腹腔接种小鼠,建立小鼠弓形虫体内感染模型,实验设(1)对照组(感染后不作药物干预);(2)青蒿琥酯组;(3)阿奇霉素组;(4)青蒿琥酯联合阿奇霉素组。接种后2h治疗组首次给药,每天给药一次,连续干预7天,观察小鼠存活时间以及抽取腹腔液检查速殖子。结果:1.体外孵育24h后速殖子感染巨噬细胞体系各组分比例变化1)青蒿琥酯组(1)游离速殖子:1.5625μg/ml组与对照组比较无明显减少(P>0.05),3.125μg/ml起呈梯度下降(P<0.05),50μg/ml组游离虫体比例低于0.3%。(2)感染巨噬细胞:与对照组比较,1.5625,3.125μg/ml组比例相对升高(P<0.05),随着浓度的升高比例逐渐下降,12.5μg/ml起明显低于对照组(P<0.05),至50μg/ml感染巨噬细胞比例低于0.3%。(3)未感染巨噬细胞:与对照组相比,1.5625,3.125μg/ml组无明显变化(P>0.05),自6.25μg/ml起逐渐增加(P<0.05)。(4)巨噬细胞感染率:整体呈下降趋势,1.5625,3.125μg/ml时高于对照组(P<0.05),至6.25μg/ml时明显下降(P<0.05),50μg/ml组巨噬细胞感染率低于1.6%。2)阿奇霉素组(1)游离速殖子:与对照组比较,随着浓度的递增显著下降(P<0.05),400μg/ml组游离虫体比例低于0.6%。(2)感染巨噬细胞:12.5μg/ml组与对照组比较有所增加(P<0.05),随后逐渐下降,50μg/ml起明显低于对照组(P<0.05),至400μg/ml感染巨噬细胞比例低于0.4%。(3)未感染巨噬细胞:随着浓度的增加逐渐上升,自25μg/ml起上升明显(P<0.05)。(4)巨噬细胞感染率:与对照组比较,12.5μg/ml组有所升高(P<0.05),随着浓度的增加逐渐下降,25μg/ml起明显低于对照组(P<0.05),400μg/ml时巨噬细胞感染率低于3.5%。3)青蒿琥酯联合阿奇霉素组(1)游离速殖子:与对照组比较,随着浓度的增加各组游离速殖子的比例显著减少(P<0.05),Art12.5+Azm100μg/ml组游离虫体的比例低于0.04%。(2)感染巨噬细胞:随着浓度的增加比例逐渐减少(P<0.05),Art12.5+Azm100μg/ml组感染巨噬细胞比例低于0.2%。(3)未感染巨噬细胞:随着浓度的增加比例逐渐升高,与对照组比较各浓度组差异均有统计学意义(P<0.05)。(4)巨噬细胞感染率:与对照组比较,随着浓度的升高显著降低(P<0.05),至Art12.5+Azm100μg/ml组巨噬细胞感染率低于1.8%。荧光显微镜下见各作用组随着药物浓度梯度上升,绿色荧光密度逐渐降低,强度减弱,虫体荧光轮廓变圆变小最后消失。姬姆萨染色显示各作用组在低浓度时虫体开始肿胀变圆有空泡形成;随着浓度增加,虫体空泡增多变大,胞浆内部结构消失,胞质呈溶解样改变;最后胞膜破裂,胞核固缩深染。2.再转种试验(1)青蒿琥酯组:1.5625至12.5μg/ml组小鼠于接种后的第7至12天陆续死亡,死亡小鼠腹腔液涂片阳性。25至200μg/ml组均存活至15天,其中25μg/ml组均已发病,50μg/ml组阳性鼠数为1,100及200μg/ml组小鼠无明显变化,涂片阴性。与对照组比较,1.5625,3.125μg/ml组小鼠平均生存时间差异无统计学意义(P>0.05),6.25至200μg/ml组存活时间明显延长(P<0.05)。(2)阿奇霉素组:12.5至50μg/ml组于接种后的第9至13天陆续死亡,涂片阳性。其余各组均存活至第15天,其中100μg/ml组均发病,200μg/ml组阳性鼠数为4,400μg/ml组阳性鼠数为1,800及1600μg/ml组涂片阴性。与对照组比较,12.5,25μg/ml组小鼠平均生存时间差异无统计学意义(P>0.05),50至1600μg/ml组延长显著(P<0.05)。(3)青蒿琥酯联合阿奇霉素组:Art1.5625+Azm12.5μg/ml至Art6.25+Azm50μg/ml各组于接种后的第8至12天陆续死亡,涂片阳性。其余各组均存活至第15天,涂片阴性。Art1.5625+Azm12.5,Art3.125+Azm25μg/ml组与对照组比较平均生存时间差异无统计学意义(P>0.05),Art6.25+Azm50至Art50+Azm400μg/ml组则显著延长(P<0.05)。3.治疗效果青蒿琥酯组于接种后第15天无小鼠存活,死亡小鼠腹腔液涂片阳性。阿奇霉素组全部存活至第30天,涂片阴性见大量巨噬细胞。联合治疗组第20天无小鼠存活,涂片阳性。青蒿琥酯组与对照组比较小鼠平均生存时间差异无统计学意义(P>0.05),阿奇霉素及联合组均显著延长(P<0.05)。结论:1.青蒿琥酯具有显著的体外抗弓形虫作用,且在一定范围内与药物浓度呈正相关,50μg/ml浓度24h可达到99%以上的杀速殖子效果,抑制巨噬细胞内虫体的增殖,降低巨噬细胞感染率,而阿奇霉素在400μg/ml方接近此效果。联合作用组效果最佳,Art12.5+Azm100μg/ml组抗虫效果与Art50μg/ml或者Azm400μg/ml组相近,同等杀虫效果下浓度梯度降低,药物剂量减小。荧光密度变化与流式检测结果一致。姬姆萨染色从形态学角度验证了药物的体外杀虫作用。2.再转种试验显示,小鼠发病趋势、平均生存时间,腹腔液涂片镜检结果均支持体外试验结果,进一步验证了药物体外抗弓形虫效果。3.初步的体内干预治疗显示,在本试验给药剂量和方法下,青蒿琥酯仅一定程度上延长了弓形虫感染小鼠的存活时间,显著弱于其体外抗虫效果。阿奇霉素组效果最为显著。联合治疗组小鼠平均生存时间与对照组比较显著延长,但并不优于阿奇霉素组。
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