论文部分内容阅读
背景:目前治疗脑中风的药物和方法有限且效果不佳，缺血预处理诱导脑缺血耐受现象的发现为脑中风的防治开辟了全新的思路，但由于方法的局限性，缺血预处理很难运用于临床脑保护。本研究室前期的研究已证实，高压氧预处理(HBO一PC)能够诱导脑和脊髓的缺血耐受，可以显著地模拟缺血预处理的脑保护作用。因其安全、可行，有望成为临床上预防和减轻脑缺血再灌注损伤的有效方法，并已有研究报道将高压氧预处理用于临床预防冠状动脉搭桥术病人的心肌缺血再灌注损伤。我们以往的研究表明，HBO一PC通过刺激机体产生少量的氧自由基，上调内源性抗氧化酶，诱导神经保护作用。然而，HBO一PC诱导脑缺血耐受的确切机制仍需进一步研究，临床上如何合理应用HBO一PC防治脑缺血损伤仍需科学理论依据。蛋白质的共价修饰包括磷酸化与去磷酸化、乙酞化与去乙酞化、甲基化与去甲基化，腺普化与去腺普化，以及一S一S一(氧化)与一SH(还原)等，共价修饰可以改变蛋白质的活性。过去的研究多集中在蛋白的磷酸化和去磷酸化作用，但近年来的研究发现乙酞化和去乙酞化对蛋白质的功能同样有着重要的调节作用。SirT1作为第三类去乙酞化酶，可以活化多种在细胞存活信号通路中起关键作用的转录因子。尤其在氧化应激状态下，SirT1能够显著地促进细胞存活。自噬是细胞内重要的分解代谢过程，通过自噬途径可将细胞内衰老和损伤的细胞器以及错误折叠蛋白分解代谢成可利用的氦基酸，核苷酸等，以维持细胞稳态。有研究表明，SirT1参与了予页处理对大鼠海马切片氧糖剥夺损伤的保护作用，并且自噬活化与缺血予页处理诱导的大鼠脑缺血耐受有着密切的关系。此外，另有研究报道SirT1通过去乙酰化自噬相关蛋白，调节自噬体的形成。基于上述发现我们推测，HB0一PC通过促进少量氧自由基生成，上调SirT1的表达，活化SirT1下游转录因子，诱导自噬途径，产生脑保护作用。本实验利用大鼠局灶性脑缺血模型和大鼠脑皮层神经元氧糖剥夺模型，运用体内siRNA干涉及体外重组腺病毒转染技术，对HB0一PC脑保护机制进行了系统地研究。实验一SirT1在fIB()一Pc诱导大鼠脑缺血耐受中的作用目的：探讨SirT1在HB0一PC脑保护中的作用方法：1)HB0一PC脑缺血半暗带区SirT1的表达。选择成年雄性SD大鼠，采用线栓法右侧大脑中动咏阻闭(MCA0)为局灶性脑缺血模型。连续5天高压氧予页处理(2．5ATA，100％02，1 h·d。。)后24 h行MCA0 120 nljn，然后再灌注24 h。检测缺血前、再灌注后1、3、6、12、24 h时间点SirT1蛋白的表达以及再灌注后3 h Sir]r1的mRNA表达，免疫荧光双标定位。2)SirT1对HB0一PC脑保护作用的影响。应用SirT1激动剂、抑制剂及SirT1siRNA分别上调和下调SirT1，检测再灌注后24h大鼠神经行为学评分和脑梗死容积。SirT1激动剂白藜芦醇灌胃，50 mg·KG-1，1次·d-1，15天；SirT1抑制剂EX527分1、10、30 ug三个剂量于HB0一PC前行侧脑室注射，连续5天；侧脑室注射SirT1 siRNA，5 ug，16 u1，注射后1～7天检测脑组织中SirT1的表达。结果：HB0一PC能够改善大鼠脑缺血再灌注损伤后神经行为学评分，缩小脑梗死容积。与缺血再灌注损伤相比，HBO—PC显著增加SirT1的蛋白和mRNA表达。从再灌注后3h开始SkTl蛋白表达增加，至少可持续至24h，且主要是在脑缺血半暗带区的神经元细胞核中。10 ug和30 ug EX527能够逆转HBO—PC的脑保护作用。相反，白藜芦醇治疗能够改善其后发生的脑缺血再灌注损伤的神经行为学评分，缩小脑梗死容积，与HBO—PC的脑保护作用相同。SkTl siRNA抑制HBO—PC诱导的SirT1的增加，消除了HBO—PC的脑保护作用。结论：HBO—PC通过上调SirT1的表达，减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤。实验二SirT1在HBO—PC诱导大脑皮层神经元缺血耐受中的作用目的：探讨SkTl在HBO—PC神经元保护中的作用方法：1)HBO—PC对神经元的保护作用。取孕16—18天SD大鼠胚胎的大脑皮层神经元体外培养。培养至第8天行HBO—PC(3．5 ATA，氧浓度>90％)处理120 min，24 h后进行氧糖剥夺(OGD)(95％N2，5％C02)120 min，复氧24 h，检测细胞存活率(MTT)和乳酸脱氢酶(LDH)漏出率。2)SkTl在HBO—PC、氧糖剥夺(OGD)损伤神经元中的表达。OGD／复氧(OGD／R)后24h检测SkTl的蛋白表达。3)SkTl对HBO—PC神经元保护作用的影响。采用重组腺病毒体外转染技术，将携带有SkTl基因(Ad—SkTl)和SkTlsiRNA(Ad-siRNA—SirT1)的腺病毒转入神经元，上调和下调SkTl的表达。转染后48 h检测转染效率及转染后SkTl的表达。Ad—siRNA-SirT1转染48 h后给予HBO—PC。OGDl20min、复氧24 h后检测MTT和LDH漏出率。结果：大鼠皮层神经元体外培养至第6天，免疫荧光染色纯度鉴定显示，神经元纯度>95％。HBO—PC增加神经元OGD／R损害后24 h细胞存活率，降低LDH漏出率。与OGD损伤相比，复氧后24hHBO—PC增加SkTl的表达。在MOI为10、50、100的条件下，重组腺病毒Ad—SkTl转染效率依次为30％、88％、95％。Ad—siRNA-SirT1转染效率依次为20％、60％、80％。Ad_SirT1转染后48 h SirT1蛋白表达显著增加；Ad—sinNA_SirT1转染SirT1显著降低。0GD／R后24 h，Ad—SirT1转染上调SirT1蛋白表达，细胞存活率增加，LDH漏出率降低。Ad_siRNA—SirT1转染抑制HB0一PC诱导的SirT1的增加，HB0一PC的神经元保护作用消失。结论：HB0一Pc通过上调sirTl的表达，减轻体外培养大鼠皮层神经元的0GD／R损伤。实验三自噬在ItB()一Pc诱导大鼠脑缺血耐受中的作用目的：探讨自噬在HB0一Pc脑保护中的作用方法：1)HB0一PC脑缺血半暗带区自噬的表达。选择成年雄性SD大鼠，给予HB0一PC和MCA0处理。检测缺血前、再灌注后1、3、6、12、24 h时间点自噬相关蛋白LC3一II表达变化以及再灌注后6 h Beclin 1的表达和自噬体的形成以及免疫荧光双标定位。2)自噬对HB0一PC脑保护作用的影响。分别应用自噬抑制剂和激动剂抑制和活化自噬，缺血再灌注后6 h检测LC3一II和BecliJl 1蛋白表达。再灌注后24 h检测神经行为学评分和脑梗死容积。自噬抑制剂3一甲基腺嘌呤(3一MA)30 ug于HB0一PC前行侧脑室注射，连续5天；自噬激动剂雷帕霉素，30 ng单次侧脑室注射，24 h后行MCA0。结果：HB0一PC增加LC3一II和Beclin 1蛋白表达和自噬体的形成，LC3一II从再灌注后3h开始增加至少可持续至24 h。LC3表达主要是在神经元细胞质中。3一MA抑制HB0一PC诱导的LC3一II和Beclin 1的上调，逆转HB0一PC的脑保护作用。雷帕霉素侧脑室注射上调LC3一II和Becli：n 1的表达，减轻其后发生的脑缺血再灌注损伤，改善神经功能障碍，缩小脑梗死容积。结论：HB0一Pc通过诱导自噬，减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤。