研究背景与目的 神经原肺水肿(NeurogenicPulmonaryEdema，NPE)或称为中枢性肺水肿(CPN)，或神经原性急性呼吸窘迫综合征(N-ARDS)，是一种来势迅猛、进展迅速、早期并发、短时间内危及生命的严重并发症，所以中枢神经性因素是肺水肿的重要原因之一。常见的中枢性原因如：颅脑损伤、脑卒中、脑肿瘤、癫痫、脑炎及其他颅内感染等。 传统的理论认为：肺水肿的发病机制主要是由于液体静水压过高(心源性肺水肿)和肺泡毛细血管通透性增加(非心源性)所致。但是，自Goodman首次发现肺泡上皮细胞存在钠主动转运方式后，接下来大量的研究均表明，肺水肿的形成除静水压力和上皮通透性的影响外，还受上皮细胞液体清除功能的影响，而这种清除功能是以钠水的主动转运形式来实现的。即肺水肿的机制中可能存在“二个增水、一个减水”的机制，这一种肺泡液体平衡调节减水机制的发现和证实，将带来肺水肿发生机理观念的重大改变。我们前期的工作也证明存在肺水肿发生的“第三机制”，该机制的干预也可能将带来治疗上的重大突破。 肺泡上皮细胞覆盖95％的肺泡面积，由扁平的Ⅰ型细胞和立方状的Ⅱ型细胞组成。Ⅱ型细胞数量较Ⅰ型细胞多，除分泌表面活性物质外，还存在水通道(aquaporin，AQP)、钠通道、Na+，K+-ATP酶，提示肺泡Ⅱ型上皮细胞在肺泡液体平衡调节中起着重要的作用，奠定了Ⅱ型细胞在钠水转运中的地位，所以对肺泡Ⅱ型上皮细胞钠通道功能的研究，有着十分重要的意义和价值。由于目前还不能分离和培养Ⅰ型细胞，且数量上也较少，无证据表明其参与钠水的主动转运。 水通道蛋白(AQPs)是一组水选择性通道膜蛋白，其功能可增加细胞膜水的通透性，它提供了液体快速移动途径。目前，在哺乳动物中已发现¨种AQPs，其中6种在呼吸道和肺组织有表达，AQP1主要分布于肺毛细血管内皮、气道粘膜上皮和胸膜，肺泡Ⅱ型上皮细胞亦有少量分布。在损伤或感染等引起的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)中，肺泡腔、间质和毛细血管间水的转运障碍形成了肺水肿。肺泡Ⅱ型细胞是肺泡上皮的干细胞，是一种多功能肺细胞，在肺水转运中起着非常重要的作用。在ARDS状态下肺泡Ⅱ型细胞AQPs表达变化的研究还未见报道。我们的研究目的是在成功建立大鼠ARDS模型并分离纯化肺泡Ⅱ型细胞的基础上确定大鼠肺泡Ⅱ型细胞膜上是否存在AQP1，并进一步观察大鼠在油酸所致ARDS状态下Ⅱ型细胞AQP1表达的变化，为ARDS发病机制的研究提供新的实验和理论依据。 我们通过大量的基础工作，在预实验获得一定结果的基础上，拟通过应用膜片钳技术的全细胞电位固定模式，观察急性分离后5h内的正常和油酸ARDS模型中大鼠肺泡Ⅱ型细胞全细胞钠电流的大小及其对钠转运抑制剂、激动剂的反应，为ARDS发病机制的研究提供新的实验方向和依据，从而进一步完善对ARDS肺水肿发生机理的认识。 研究方法 实验动物选用壮年健康雄性Sprague-Dawley大鼠(由南方医科大学实验动物所提供)，体重180-235g。本实验分为三部分，实验的第一部分是建立有效分离正常和油酸ARDS模型大鼠的肺泡Ⅱ型上皮细胞的方法；第二部分主要是水通道蛋白在该细胞的表达的研究；第三部分主要是该细胞钠转运功能的研究。 在实验第一部分中，主要是通过静脉注射油酸建立ARDS大鼠动物模型。油酸模型是目前公认比较好的ARDS模型。 第二部分是在第一部分实验成功获得高纯度和高活力肺泡Ⅱ型上皮细胞的基础上，通过免疫组化、免疫电镜、WesternBloting方法鉴定肺泡Ⅱ型细胞上是否存在水通道蛋白，运用免疫组化、WesternBloting和图像分析技术，对正常大鼠和ARDS大鼠Ⅱ型细胞水通道蛋白AQP1的表达水平进行对比观察，分析变化，这部分是本课题的重点和关键之一。 第三部分主要是观察ARDS状态下肺泡Ⅱ型上皮细胞钠转运功能的状态。首先是通过观察急性分离后5小时内的肺泡Ⅱ型上皮细胞的全细胞钠电流，以明确是否能用急性分离的细胞来研究细胞钠主动转运功能，为进一步实验打下基础。 其次，我们用膜片钳实验来观察电流。本实验采用膜片钳技术中的全细胞电位固定记录模式测定电流强度。细胞封接并形成全细胞状态后，立即调节相关旋纽补偿串连电阻、补正电容性电流使其尽可能地变小，滤波频率为1kHz。 研究结果 1.我们改良后的大鼠ATⅡ细胞的分离纯化方法是可行的。经台盼兰染色测定细胞活力正常组89.6±2.6％，油酸组85.1±4.6％。经鞣酸特殊染色后鉴定ATⅡ细胞纯度，正常组纯化前细胞纯度为74.9±3.8％，纯化后明显上升至88.4±3.3％，油酸组纯化后纯度82.7±3.7％。适当降低消化酶浓度和离心速度可提高分离细胞的活力，细胞分离后用IgG免疫粘附方法纯化可使纯度提高15％，鞣酸染色和电镜鉴定可见Ⅱ型细胞上的特征性板层小体。 2.大鼠油酸ARDS模型的成功建立以及病理状态下ATⅡ细胞的成功分离是本实验能够完成的前提和基础。经大鼠尾静脉注射油酸制备ARDS急性动物模型成功率高，注入油酸后30s大鼠即出现明显的症状如呼吸急促、颜面四肢皮肤发绀等，血气分析显示PH、Pa02明显下降，PaCO2明显上升；双肺明显充血、出血以及大片水肿，肺组织HE染色观察可见肺泡和肺间质水肿、出血；毛细血管扩张、充血，粒细胞浸润；肺泡腔大量血性液体渗出，部分可见局灶性肺不张。油酸ARDS大鼠ATⅡ细胞的分离难度明显增加，分离后活力85.1±4.6％，纯度82.7±3.7％，均明显低于正常组。电镜下见细胞变性、凋亡甚至崩解，板层体排空出现空炮样改变，微绒毛消失。 3、大鼠肺泡Ⅱ型细胞上存在AQP1：免疫组化结果示正常大鼠肺泡Ⅱ型细胞AQP1呈强阳性染色，细胞被染成深棕褐色，ARDS大鼠肺泡Ⅱ型细胞AQP1呈阳性染色，阴性对照及空白对照无染色；免疫电镜见AQP1在大鼠肺泡Ⅱ型细胞膜表面呈高电子密度阳性反应或膜周围可见胶体金颗粒，阳性反应不是连续的。 4、ARDS状态下肺泡Ⅱ型细胞AQP1的表达下降：Westernblot分析显示ARDS大鼠肺泡Ⅱ型细胞AQP1蛋白条带较对照组明显减弱，免疫组化及Westernblot经图像分析结果为ARDS状态下Ⅱ型细胞上水通道蛋白1的表达较对照组有明显的下降，经统计学分析有显著差异(P＜0.05)。 5.急性分离的肺泡Ⅱ型上皮细胞具有钠主动转运功能。在全细胞的电位固定记录模式下，我们成功地记录到急性分离后5小时内的大鼠ATⅡ细胞的跨膜电流。当应用SES为浴液时，该电流的翻转电位在0mv左右；而当浴液中含有10μM阿米洛利时，该细胞的跨膜电流明显减小，且翻转电位明显改变，约为-40mv。由此可见该跨膜电流是以阿米洛利敏感性钠电流为主，其翻转电位约为+50mv。 6.给予细胞-100mv刺激时正常组全细胞钠电流-101.11±11.41PA，而油酸组为-65.17±11.48PA，较对照组明显下降(p＜0.01)，但二者均能被阿米络利显著抑制；油酸组对特布他林的敏感性较对照组有所增高，应用特布他林后全细胞钠电流可上升一倍以上，经统计学分析二者之间存在显著差异(p＜0.01)。 结论 1.采用改良的胰酶消化法可以成功分离正常和油酸ARDS大鼠的ATⅡ细胞，用大鼠IgG包被培养皿纯化细胞、鞣酸染色法鉴定细胞纯度简单可行，而透射电镜是鉴定细胞的金标准。 2.经尾静脉注射油酸建立大鼠ARDS急性模型是一个相对简单而成功率高的方法，大鼠血PaO2明显下降，PaCO2明显上升，肺部出现明显病理改变，上皮细胞的超微结构也出现明显变化。 3.ARDS大鼠肺泡Ⅱ型细胞的分离难度大，细胞活性低、脆性大，成功的分离是整个实验的基础。ARDS大鼠肺泡Ⅱ型细胞的成功分离是本实验的一个创新点。 4.AQP1存在于大鼠肺泡Ⅱ型细胞膜上。 5.ARDS状态下肺泡Ⅱ型细胞AQP1的表达较对照组有显著的下降(P＜0.05)。本研究从组织、细胞、蛋白分子3个不同层面和水平研究了ARDS大鼠肺泡Ⅱ型细胞上AQP1表达的变化。国内外尚未见报道，为本实验的主要创新点。肺泡Ⅱ型细胞上AQP1在ARDS状态下的变化提示AQP1对呼吸系统水转运可能起到重要作用，有临床意义。 6.急性分离的肺泡Ⅱ型上皮细胞具有钠主动转运功能，其全细胞钠电流能够被阿米洛利明显抑制，而特布他林则可使该电流明显增大，提示钠通道抑制剂和激动剂均能对其产生影响。观察急性分离的ATⅡ细胞钠电流是本实验的创新点之一。 7.ARDS状态下，ATⅡ细胞受损明显，其病理改变以凋亡为主，但其仍旧具有一定的钠转运功能，且对钠通道激动剂的敏感性较正常增加，对于临床ARDS的防治具有一定的意义。研究病理状念下ATⅡ细胞的钠电流及其调节是本实验的又一创新点。